大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性(2),分子生物学论文.docx

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1、大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性(2),分子生物学论文 通过RT-PCR成功地从鸡肺组织mRNA中扩增出预期大小的目的条带。将该PCR产物连接入pMD19-T载 体 中，阳 性 克 隆 被 命 名 为pMDT-cSPA.测序结果发现，该基由于cSP-A,与GenBank中登 录 的 序 列登 录 号：AF411083的 同 源 性 为100%.为便于在大肠杆菌中表示出，剪去其信号肽部分，以pMDT-cSPA质 粒 为 模 板，以cSPA-55F和cSPA-R为上、下游引物扩增出cSP-A成熟肽基因，双酶切PCR产物，再克隆 入 原 核 表 达 载 体pCold-TF中。经PCR鉴定

2、和测序，结果成功构建了表示出cSP-A成熟肽基因片段的原核表示出载体，遂将其命名为pCold-cSPA见图1。 2.2重组蛋白的表示出和纯化 在16 培 养 条 件 下，分 别 经 终 浓 度 为0.1、0.2、0.5和1mmol/L IPTG诱 导pCold-cSPA 24h,SDS-PAGE鉴 定 发 现：用 终 浓 度 为1 mmol/LIPTG诱导菌，pCold-cSPA的表示出量 相 对 较 大，表示出产物大 小 约 为80ku见 图2A。随 后，利 用1mmol/L IPTG大量诱导阳性克隆菌200mL,经超声波裂解后，融合蛋白主要以上清形 式存在见图2B。取表示出上清参加到平衡好

3、的His Tag树脂中，表示出上清与树脂悬液的比例约为51;最后分段收集洗脱液，取少量进行SDS-PAGE检测，结果成功获得纯化的cSP-A融合蛋白见图3。 2.3 Western-blot分析 用抗cSPA-CRD小鼠多克隆抗体血清对纯化后的cSP-A蛋白进行Western-blot检测。结果显示，在80ku处出现单一的特异性条带见图4，表示清楚诱导表示出的cSP-A重组蛋白能被抗其多克隆抗体特异性辨别。 2.4抑菌活性检测 采 用 单 层 琼 脂 平 板 扩 散 法 检 测 原 核 表 达 的cSP-A蛋白对各个指示菌的抑菌情 况，结 果见 图5显示，阳性对照即天然cSP-A蛋白和卡那霉素

4、对巴氏杆菌、大肠杆菌CMCC44102、甲型副伤寒沙门菌ATCC9150、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌CMCC29212均有一定的抑菌活性，但原核表示出的cSP-A蛋白没有明显的抑菌活性。 3讨论 与哺乳动物源SP-A比拟，发现cSP-A有以下4点不同。第一，CLR区不完好，仅包括一个胶原样G-X-Y三联体重复序列，有趣的是，同样定位于鸡6号染 色 体 上 的 鸡 肺 凝 集 素chicken lunglectin,cLL在基因构造上无CLR区8,但重组cLL蛋白能抑制人H3N2和H1N1亚型流感病毒的血凝活第11期黄琪等：鸡肺外表活性蛋白A的可溶性表示出及活性检测性9,提示CL

5、R区完好性 对 其 凝 集 活 性 的 影 响 不大。第二，通过软件模拟cSP-A空间构造发现，尽管cSP-A的茎区较短，但其与猪、人源的SP-A的单体构造极其类似，似乎并 不影 响空间构造的构成。第三，多出了一个未知区，由54aa组成，这一区域的功能有待确定。第四，CRD区不仅有2个糖基化位点，2个钙离子结合位点，还有1个结合甘露糖的基序215EPN217，这一基序可能会使CRD结合病原微生物糖蛋白的作用更为显着10.基于这四点不同，有必要对cSP-A的全基因进行表示出并进而获得大量可溶性cSP-A蛋白纯品，以研究其基因构造与生物学功能的关系，并期望将来用于临床研究。 原核表示出系统是获取大

6、量蛋白质的最直接途径，但是cSP-A全基因中有多个大肠杆菌的稀有密码子。为此，笔者曾尝试多种原核表示出载体进行表示出，但均未获得成功，只要在表示出cSP-A基因的部分片段例如N端区和C端CRD区，且突变了大肠杆菌的稀有密码子后才获得了高效表示出，但表示出产物均为包容体，不宜进行生物活性的研究。为此，本研究选择pCold-TF原核 表示出载体，该表示出载体带有冷休 克 蛋 白AcspA启 动 子，融 合 触 发 因 子TF、蛋白质水解位点和His标签分子，在低温环境中经IPTG诱导表示出，不仅可加强目的蛋白的稳定性，而且有效促进融合蛋白的可溶性表示出，便于蛋白质纯化，保证目的蛋白的天然活性11.

7、最终研究结果显示，cSP-A成熟肽在该载体中获得了高效可溶性表 达；Western-blot结 果 显 示，该 蛋 白 质 可 被cSPA-CRD多克隆抗体特异性辨别，表示清楚cSP-A重组蛋白具有良好的反响原性见图4。 cSP-A与 哺 乳 动 物 源SP-A序 列 的 同 源 性 不高，本研究通过抑菌试验证明：cSP-A蛋白原核表示出产物无明显抑菌功能，而天然鸡肺灌洗液SP-A蛋白可高效抑制部分常见革兰阴性菌巴氏杆菌、甲型副伤寒沙门菌、大肠杆菌和革兰阳性菌粪肠球菌、金黄色葡萄球菌见图5。这可能与原核表示出产物没有天然蛋白的翻译后修饰，也不能构成三聚体，进而不能发挥天然蛋白的类似活性所致。下

8、一步将通过cSP-A全长真核分泌性表示出、杆状病毒载体真核表示出系统等途径解决其生物学活性问题。 以下为参考文献References 1BERNHARD W,GEBERT A,VIETEN G,et al.Pulmonarysurfactant in birds:coping with surface tension in a tubularlungJ.Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol,2001,2811：327-337.、 2VELDHUIZEN E J,VAN EIJK M,HAAGSMAN H P.Thecarbohydrate recognit

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