载脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化,病理学论文.docx

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1、载脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化,病理学论文成纤维细胞作为动脉外膜最主要的细胞成分，在环境因素发生改变时具有调整其表型的能力。在血管内皮损伤的模型中，外膜表现出了显著增厚，其主要就是由于外膜成纤维细胞转化成肌成纤维细胞聚集引起的。但是关于动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞表型转化的报道甚少，本研究将通过整体动物及体外实验观察载脂蛋白E基因敲除(ApoE/)小鼠血管外膜成纤维细胞表型的变化，讨论血管外膜成纤维细胞表型转变在早期动脉粥样硬化病灶构成中的作用。 1、材料与方式方法 1.1主要材料 6周龄ApoE/小鼠和C57BL/6鼠购于北京大学医学部。DMEM培养基、胎牛血清购于

2、美国Gibicol公司。兔多克隆抗体转化生长因子 1(transforming growth factor- 1，TGF- 1)购于美国SantaCruz公司;抗小鼠波形蛋白(vimentin)抗体、抗小鼠结蛋白(desmin)抗体及抗小鼠 平滑肌肌动蛋白( -smooth muscleactin， -SM-actin)抗体购于美国NeoMarkers公司;鼠组织免疫组织化学试剂盒购于福州迈新试剂公司;兔即用型SP免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司;链霉亲和素-生物素-异硫氰酸酯(streptavidin-biotin complex-fluoresceine isothiocya

3、-nate，SABC-FITC)及链霉亲和素-生物素-cy3(streptavidin-biotincomplex-cy3，SABC-cy3)试剂盒购于武汉博士德公司。DAPI购于美国Sigma公司。 1.2标本制备 6周龄ApoE/小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分别给予高脂饲料(基础饲料84.75%，饱和脂肪15%，胆固醇0.25%)喂养2周、4周和8周。在各个时间点处死动物后取升主动脉用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制备连续切片。 1.3免疫组织化学染色 选取部分切片进行免疫组织化学染色检测 -SM-actin和Vimentin的表示出，按鼠组织免疫组织化学试剂盒讲明书操作。按兔即用型SP免

4、疫组织化学试剂盒讲明检测Desmin的表示出。部分切片进行免疫荧光染色检测TGF- 1的表示出，按SABC-cy3试剂盒讲明书操作，显微镜下观察采集图像。 1.4血管外膜成纤维细胞的培养 6周龄野生型C57BL/6小鼠和ApoE/小鼠，高脂喂养2周后，颈椎脱臼处死，无菌开胸取出整条主动脉，仔细去除血细胞及血管周围脂肪组织，解剖显微镜下小心剥离外膜。用眼科剪将组织剪碎成约1mm3小块，接种到培养瓶中，参加含15%胎牛血清的DMEM培养基，于37、5%CO2干涸培养24h待组织块贴牢后轻轻翻转培养瓶继续静置培养，观察大部分组织块周围爬出细胞，融合成片时，用0.25%胰蛋白酶消化并采用差速贴壁法纯化

5、两次。 选取第35代细胞，进行后续实验。 1.5免疫荧光染色检测体外培养成纤维细胞中Vi-mentin、 -SM-actin和Desmin的表示出 取对数生长期细胞，0.25%的胰酶将细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5 108cells/L，接种于带爬片的6孔板中，静置培养48h待细胞长至亚融合状态后，血清饥饿24h，然后更换含有10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，弃去培养液，取出细胞爬片。PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS冲洗3遍，3%过氧化氢室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶。之后Vimentin免疫荧光染色按SABC-FITC试剂盒进行， -SM-a

6、ctin及Desmin免疫荧光染色按SABC-cy3试剂盒进行。 1.6透射电镜观察细胞超微构造 取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化细胞成单细胞悬液，调整细胞浓度为5 109cells/L，接种于新培养瓶中，后静置培养48h待细胞长至亚融合状态，血清饥饿24h，更换含10%胎牛血清的DMEM，继续培养24h，然后收集细胞约(1520) 106个培养细胞，经过固定、漂洗、脱水、浸透包埋与聚合、切片、染色后透射电镜下观察细胞超微构造。 1.7WesternBlot检测 -SM-actin及TGF- 1蛋白的表示出 收集细胞参加100 L细胞裂解液，冰上孵育20min，10000 g离心5mi

7、n，取各组细胞的裂解液10 L，各参加5 L上样缓冲液，混匀。水中煮沸35min，10000 g离心1min，冰上放置，上样。经电泳、考马斯亮兰染色、脱色，转膜，封闭后参加一抗 -SM-actin或TGF- 1，4杂交过夜。洗膜后参加辣根过氧化物酶标记的二抗37孵育1h，洗膜，化学发光法显色。结果作半定量分析。 1.8统计学分析 检测结果均用x s表示，采用软件SPSS11.5进行分析，两组间比拟采用t检验，以P0.05表示差异有显著性。 2、结果 2.1免疫组织化学染色检测血管外膜 -SM-actin的表示出 各个时间点的ApoE/小鼠血管外膜大部分细胞呈现Vimentin阳性表示出，Des

8、min始终呈阴性，而中膜细胞对Vimentin、Desmin、 -SM-actin三种单抗均呈阳性反响。高脂喂养2周的ApoE/小鼠血管外膜部分细胞检测到 -SM-actin阳性表示出，此时并无可见内膜病灶构成，高脂喂养4周后内膜出现泡沫细胞，血管外膜 -SM-actin阳性表示出增加，但8周后外膜 -SM-actin呈弱阳性表示出，此时内膜动脉粥样硬化病灶进一步发展，内膜 -SM-actin表示出呈阳性。而C57BL/6小鼠血管外膜细胞只检测到Vimentin阳性表示出，始终未检测到 -SM-actin阳性表示出(图1)。 2.2免疫荧光染色检测TGF- 1表示出 6周龄ApoE/小鼠(高脂

9、喂养前)和各个时间点的C57BL/6小鼠主动脉外膜细胞均无TGF- 1的表示出，高脂喂养2周后，ApoE/小鼠主动脉外膜细胞呈现TGF- 1弱阳性表示出。高脂喂养4周后，主动脉外膜细胞TGF- 1表示出加强，此时内膜损伤处呈现TGF- 1弱表示出，高脂喂养8周后主动脉外膜和内膜损伤处呈现TGF- 1强阳性表示出(图2)。 2.3免疫荧光染色检测体外培养成纤维细胞 Vim-entin、 -SM-actin和Desmin ApoE/小鼠血管外膜成纤维细胞除了Vimen-tin染色阳性外，还有部分细胞表现为 -SM-actin染色阳性，但Desmin染色一直呈阴性。C57BL/6小鼠血管外膜成纤维细

10、胞仅表现为Vimentin染色阳性，而Desmin和 -SM-actin均呈阴性反响(图3)。 2.4透射电镜观察细胞超微构造 C57BL/6小鼠血管外膜细胞主要表现出典型成纤维细胞的特征，细胞呈梭形或者不规则形，有多个较长的胞质突起，核为卵圆形，偶见微管微丝。而ApoE/小鼠血管外膜细胞有部分细胞的超微构造发生改变，可见肌丝明显增加，呈现出肌成纤维细胞的特征(图4)。 2.5 -SM-actin及TGF- 1蛋白的表示出 ApoE/小鼠成纤维细胞 -SM-actin(5.102 0.896)及TGF- 1(7.573 1.043)蛋白表示出水平都明显高于C57BL/6小鼠(0.126 0.5

11、21和0.279 0.769)，差异有显著性(P0.05;图5)。【图】 3、讨论 血管外膜长期以来被以为只是充当内皮损伤始动动脉粥样硬化病灶构成的 配角 ，随着研究的深切进入，越来越多的证据显示外膜能够通过由外而内的作用影响血管中膜及内膜。外膜是多种血管活性因子的主要来源，是血管重塑经过中的重要介入者。 血管外膜发生的变化(如结缔组织生成增加、炎症反响以及细胞改变等)可能是即将发生的血管疾病的信号。在对损伤的反响经过中，外膜细胞可表现出不同的构造和功能行为，有报道在中度和重度球囊损伤实验模型中外膜的成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。动脉损伤后早期血管外膜成纤维细胞逐步转化为肌成纤维细胞。成纤

12、维细胞的表型转化和增殖活性改变介入并促进了血管桥再狭窄的发生经过。在移植性血管病模型中发现新生内膜增生之前外膜即出现大量a-SM-actin阳性的肌成纤维细胞。但是关于动脉粥样硬化早期血管外膜成纤维细胞表型转化的报道甚少。本实验观察了ApoE/小鼠动脉粥样硬化病灶构成经过中血管外膜成纤维细胞表型的变化。结果发现高脂喂养2周和4周后的ApoE/小鼠血管外膜细胞发生了表型改变，其在逐步获得 -SM-actin表示出的同时，Desmin染色持续阴性，Vimentin则持续呈阳性表示出。Vimentin为间质细胞标记物，Desmin则是高分化平滑肌细胞的标记物，结果显示所测细胞为成纤维细胞，并表现出向

13、肌成纤维细胞转化的特征。体外培养成纤维细胞结果也证实ApoE/小鼠血管外膜部分细胞的超微构造发生改变，可见肌丝明显增加，呈现出肌成纤维细胞的特征。免疫荧光染色除Vimentin染色阳性外，还有部分细胞表现为 -SM-actin染色呈阳性，但Desmin染色一直呈阴性，结果讲明ApoE/小鼠血管外膜细胞仍保持了成纤维细胞的表型特点，但有部分转化为肌成纤维细胞，而非典型平滑肌细胞。肌成纤维细胞是一种具有平滑肌细胞样特点的成纤维细胞。它也能分泌细胞外基质和多种生物活性因子介入组织修复，一旦创伤愈合，肌成纤维细胞迅速回转到成纤维细胞或进入凋亡。 本研究结果显示高脂喂养8周后的ApoE/小鼠血管外膜呈现

14、 -SM-actin弱阳性表示出，这可能表示肌成纤维细胞向内膜迁移，或又转为成纤维细胞，或进入凋亡。 很多生长因子，如血小板源生长因子(PDGF)、TGF- 、肿瘤坏死因子 (TNF- )和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等都介入了成纤维细胞表型转化的经过。华而不实TGF- 1介入了多种细胞的增殖及分化，其可诱导大鼠腹膜间皮细胞转化。大鼠肺动脉高压的肺组织中TGF- 1表示出水平也显著增高。TGF- 1是当前公认的能直接诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞进行表型转化的诱导因子。 我们在实验中也观察到ApoE/小鼠随着高脂喂养时间延长，主动脉外膜TGF- 1的表示出增加，进而促使成纤维细胞转化为肌成

15、纤维细胞。体外实验结果也显示ApoE/小鼠血管外膜成纤维细胞中TGF- 1蛋白表示出水平明显高于C57BL/6小鼠。成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后又会分泌基质蛋白、细胞因子等，进行大量增殖，并且迁移到新生内膜中，可促进平滑肌细胞和内皮细胞的增殖。增加的细胞外基质又可进一步促进成纤维细胞增殖及表型转化来介入血管重塑。因而成纤维细胞转化为肌成纤维细胞后将有助于动脉粥样硬化病灶构成。 本研究结果提示动脉粥样硬化病灶构成早期血管外膜成纤维细胞即出现表型转变为肌成纤维细胞的特性，进而影响外膜和血管中膜及内膜之间的交互对话，介入动脉粥样硬化病灶的构成及进展，这可能成为抑制不良血管重塑的干涉靶点。 以下为参

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