检测与探讨Dlx1as在发育过程中的表达,分子生物学论文.docx

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1、检测与探讨Dlx1as在发育过程中的表达,分子生物学论文非编码 NA 在基因调控方面有着重要功能，可广泛介入基因调控的各个层面，在发育、癌症、神经功能紊乱等生物经过中都发挥重要作用1。在长非编码NA 中有一重要亚类，天然反义转录本，是从已经知道转录序列的互补链转录的转录物2。有学者提出一些分子模型来解释天然反义 NA 产生功能的分子机制，如转录干扰、NA 遮蔽、双链 NA 降解、翻译干扰等3。已经有研究表示清楚，长非编码 NA 与转录因子的编码基因有着更密切的联络4。Dlx1as 是诸多天然反义 NA 中较早被发现的，但到当前为止，关于其详细生物学功能的报导很少。Dlx1as 在基因座位上位于

2、进化上极其保守的两个转录因子 Dlx1 与 Dlx2之间5-6。Evf 2 作为 Dlx1 同源蛋白 Dlx5-Dlx6 基因座位中的天然反义转录物，已被证实能够反式调节另一个同源基因 Dlx27。本研究以小鼠的大脑发育为模型，检测与讨论了 Dlx1as 在发育经过中的表示出，分析 了 其 对 Dlx1 编 码 基 因 产 生 影 响 的 可 能机制。 一、材料和方式方法 材料 pGEM-T 载体、质粒提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒购自天根生化科技 ( 北京) 有限公司，反转录试剂盒购自全式金生物科技公司，实时定量 PC 试剂盒、Nase-Free DNaseI 购自日本 Takara 公司，

3、Trizol购自美国 Invitrogen 公司，T4 DNA 连接酶购自美国Promega 公 司。 E12. 5、 E14. 5、 E16. 5、 E18. 5、 P1、P7 及成年小鼠品系均为 IC 品系，由中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心饲养。冰冻切片机为莱卡 CM1950 ( 实验室器材) 。 组织 NA 的提取及去 DNA 处理 取新鲜鼠脑组织，根据 1 mg 组织1 ml 的比例参加 Trizol，使用高速匀浆器进行破碎，之后参加 200 l 氯仿抽提，412 000 r / min离心 20 min; 汲取上清 500 l，参加等体积异丙醇，4放置 1 h，4 12 0

4、00 r/min 离心 20 min;弃上清，75% 乙醇 1 ml 漂洗 2 次，晾干，参加适量DEPC 水溶解。根据 10 g 总 NA 参加 10U DNase与相应体积的 10 buffer，37反响 30 min，70热失活 5 min。 T-PC 使用 2 g 总 NA 作为模版，1 l( 50 pm) OligdT 作为引物，2 buffer 10 l、反转录酶1 l、DEPC-水补足 20 l 体系。阴性对照的 PC 体系中未加逆转录酶。 实时定量 PC 用等量 cDNA 作为模版，20 l总体系，0. 5 l-Primer-F，0. 5 l-Primer-，10 l-2 Mi

5、x，使用 GAPDH 为内参，对 Dlx1 mNA 与 Dlx1as 进行定量检测。实时定量 PC 引物序列见表 1。 克隆与测序 将 T-PC 得到的特异条带进行切胶回收，用 DNA 纯化试剂盒纯化，将纯化的 DNA 产物连接到 pGEM-T 载体，连接产物转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞中，菌落 PC 鉴定阳性克隆，接菌，送美国 Invitrogen 公司测序部进行测序。 NA 探针制备 使用将 Dlx1as 与 Dlx1 mNA 的片段克隆到 pGEM-3Zf 载体，分别使用 BamH与 Hind进行线性化，醇沉回收线性化质粒，使用 T7 转录酶体系进行体外转录，Nase-Free D

6、Nase消化模版，醇沉，漂洗，50 l DEPC-水溶解，参加等体积甲酰胺，标定浓度为 50 ng/ l，分装使用。 原位杂交 使用冰冻切片机，将不同天数的鼠脑进行切片，使用杂交液进行预杂交，使用0.5 ng/ l 的终浓度探针，65 杂交过夜，使用 0. 2 SSC，65，洗脱20 min，重复 3 次，使用地高辛抗体 1 5000，4 ，杂交过夜，进行显色反响，中性树脂进行封闭保存。使用尼康显微镜进行拍照记录。 二、结 果 Dlx1as 分子具有多聚腺苷酸尾 使用 UCSC 公共数据库的 polyA 信号分析，在 Dlx1as 的末端有 1 个强烈的特征信号，强度比 Dlx1 mNA 更高

7、层次; 采用 OligdT和 andom primer 进行反转录，以得到的 cDNA 为模版进行 PC 扩增，阴性对照未见条带，目的片段大小符合预期，连接 pGEM-T 载体，测序正确 ( 图 1) 。 Dlx1as 和 Dlxl mNA 在小鼠大脑胚胎期高表示出Dlx1as 和 Dlx1 mNA 在神经发育经过中出现了一段时间 内 的 高 表 达，从 E14. 5 持 续 到 E18. 5，除 在E12. 5 和成年小鼠中有显著性差异外，其余 4 个时间点均没有显著性差异。使用曲线拟合，计算得出 2=0. 71 ，P = 0. 19 ( 图 2) 。 Dlx1as 与 Dlx1 mNA 在

8、空间表示出上具有互补性从 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的时间点中，都能够看出二者的表示出部位有明显的差异不同，固然二者均较特异表示出于大脑腹侧生发区，但 Dlx1 mNA 在室周区较室周下表示出量更高层次，而 Dlx1as 则与之相反 ( 图 3) 。 三、讨 论 越来越多的证据表示清楚，一些长非编码 NA 的转录使用和 mNA 一样的转录机器，具有多聚腺苷酸尾，有可变剪切形式。本研究鉴定了经典的天然反义NA Dlx1as 具有多聚腺苷酸尾。在特定的时空表示出的NA 分子，很可能会介入特定的生物学经过。Dlx1as在小鼠胚胎期大脑中高表示出，与成年的低表示出构成鲜明的比照，揭

9、示 Dlx1as 很可能在大脑发育经过成具有重要功能。而且 Dlx1as 与 Dlx1 mNA 的表示出趋势非常类似，笔者以为可能是整个基因座位的转录被激活所导致，当然也不能排除二者的转录分别遭到调控，还需要进一步的验证转录的上游控制。 天然反义 NA 很多都通过影响 mNA 来产生效应，例如天然反义 NA Star 的表示出能够降低 StA 的蛋白表示出，在体敲低 Bdnf-AS 的表示出水平，能够使 Bdnf 的表示出水平得到大幅度的加强8-9。因而笔者揣测 Dlx1as 很可能也是通过类似方式来实现其功能的。本研究通过原位杂交，发现 E12. 5、E14. 5 和 E16. 5 的胎脑中

10、，在脑室室周，Dlx1as 与 Dlx1 mNA 有着明显的位置不同，甚至是接近互补的存在，由此揣测 Dlx1as 可能是通过对 Dlx1 mNA 的负调控来发挥功能的。在笔者撰写文章的同时，有新加坡的实验室发表了关于 Dlx1as 敲除小鼠的研究，并提出了Dlx1as 通过负向调节Dlx1 mNA的分子模型，与笔者揣测相符10。至于愈加具体的分子调控机制，还需要进行愈加深切进入细致的研究。 参 考 文 献 1 Chen LL，Carmichael GG. Long noncoding NAs in mamma-lian cells: what， where， and why J Wiley

11、Interdiscipev NA，2018 ，1( 1) : 2-21. 2 Lapidot M，Pilpel Y. Genome-wide natural antisense tran-scription: coupling its regulation to its different regulatorymechani- sms J EMBO ep，2006 ，7( 12) : 1216-1222. 3 Li K，amchandran . Natural antisense transcript: a con-comitant engagement with protein-coding

12、 transcript J On-cotarget，2018，1( 6) : 447-452. 4 Werner A. Natural antisense transcripts J NA Biol，2005，2( 2) : 53-62. 5 McGuinness T，Porteus MH，Smiga S，et al. Sequence，or-ganization，and transcription of the Dlx-1 and Dlx-2 LocusJ Genomics，1996 ，35( 3) : 473-485. 6 Panganiban G，ubenstein JL. Develo

13、pmental functions of theDistal-less / Dlx homeobox genes J Development，2002，129( 19) : 4371-4386. 7 Feng J，Bi C，Clark BS，et al. The Evf-2 noncoding NA istranscribed from the Dlx-5 /6 ultraconserved region and func-tions as a Dlx-2 transcriptional coactivator J Genes Dev，2006，20( 11) : 1470-1484. 8 C

14、astillo AF，Fan J，Papadopoulos V，et al. Hormone-depend-ent expression of a steroidogenic acute regulatory protein natu-ral antisense transcript in MA-10 mouse tumor leydig cellsJ PLoS One，2018，6( 8) : e22822. 9 Modarresi F，Faghihi MA，Lopez-Toledano MA，et al. Inhibi-tion of natural antisense transcripts in vivo results in gene-spe-cific transcriptional upregula-tion J Nat Biotechnol，2020，30( 5) : 453-459. 10 Kraus P，Sivakamasundari V，Lim SL，et al. Making sense ofDlx1 antisenseNA J Dev Biol，2020，376 ( 2) : 224-235.