转基因动物的制备方法及其运用,基因工程论文.docx

《转基因动物的制备方法及其运用,基因工程论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转基因动物的制备方法及其运用,基因工程论文.docx（15页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、转基因动物的制备方法及其运用,基因工程论文摘 要： 经过数十年的发展，转基因技术发展到今天日趋成熟，转基因动物的制备也涌现出很多的方式方法。转基因动物制备主要使用的方式方法有逆转录病毒感染法、DNA显微注射法、基因打靶技术、精子载体法和体细胞核移植法等，这些方式方法各自有其优缺点。转基因动物如今在生命科学研究、人类疾病模型、异种器官移植、动物品种改进、食品药品生产等方面有着重要应用，对人类健康和社会发展有着重大意义，但该项技术在应用经过中仍存在一些问题。动物转基因技术和转基因动物制备早已成为生命科学领域的研究热门，随着理论和技术不断向前推进，它们必将对人类的疾病治疗、生产生活、社会发展等方面产

2、生宏大的影响。 本文关键词语： 转基因技术; 转基因动物; 基因整合; Abstract： After decades of development,transgenic technology has become more and more mature,and many methods have emerged for the preparation of transgenic animals.The main methods used in the preparation of transgenic animals include retrovirus infection,DNA mic

3、roinjection,gene targeting,sperm carrier method and somatic cell nuclear transplantation,which have their own advantages and disadvantages.Nowadays,transgenic animals have important applications in life science research,human disease model,xenotransplantation,animal variety improvement,food and drug

4、 production,etc.,which are of great significance to human health and social development.However,there are still some problems in the application process of this technology.Animal transgenic technology and the preparation of transgenic animals have already become a research hotspot in the field of li

5、fe science.With the continuous advancement of theories and technologies,they will certainly have a huge impact on the treatment of human diseases,production and life,social development and other aspects. Keyword： transgenic technology; transgenic animals; gene integration; 转基因是利用基因工程技术而整合到动物受体细胞基因组中

6、的外源基因，转基因技术是使用基因工程技术使外源基因稳定整合到动物受体细胞基因组中，并能够得到表示出和遗传的生物技术，由此得来的动物即为转基因动物。1976年，Jaenisch1把猿猴病毒SV40转入了小鼠囊胚腔中，得到嵌合体小鼠，并通过将逆转录病毒与小鼠卵裂球共培养使得莫氏白血病病毒基因插入到了小鼠基因组中。1980年，Gorden等2通过显微注射获得了转入疱疹病毒胸苷激酶基因的转基因小鼠，证实了显微注射方式方法在转基因中的有效性。Palmiter等3在1982年将融合大鼠生长激素构造基因的小鼠金属硫蛋白-I基因启动子的DNA片段通过显微注射到小鼠受精卵原核中，得到拥有金属硫蛋白-生长激素融合

7、基因的快速生长的 超级小鼠 。1985年，Hammer等4通过显微注射法获得了转基因兔、羊和猪。这几项研究在转基因动物和转基因技术领域具有里程碑的意义，推动了其进一步的研究与发展。 在转基因技术发展了几十年后的今天，研究人员们将这一领域的发展不断向前推进，当前已出现很多动物转基因的技术与方式方法。包括逆转录病毒感染法、DNA显微注射法、基因打靶技术、精子载体法以及体细胞核移植法等。 1、 转基因动物的制备方式方法 转基因动物的制备在技术上大体包括几个步骤：(1)载体的构建；(2)介质细胞的获得和培养；(3)DNA的导入；(4)正确重组细胞克隆的挑选；(5)将介质细胞介入个体发育，通过受精卵本身

8、发育，或胚胎干细胞经显微操作技术注射进囊胚构成嵌合胚胎，或体细胞经显微操作技术进行核移植构成重构胚胎，然后移植进代孕动物子宫发育成个体；(6)个体的交配繁衍与稳定。不同方式方法这些环节中可能有不同5。 1.1 、逆转录病毒感染法 逆转录病毒是RNA病毒，当其进入细胞后，会在逆转录酶的作用下，其单链RNA能够逆转录为双链DNA，然后整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表示出。逆转录病毒的长末端重复序列LTRs具有转录启动子的活性，将外源基因连接到LTRs下部，再包装为病毒颗粒，直接感染受精卵或注射到囊胚腔中，含有外源基因的逆转录病毒的DNA就能够被整合到宿主的染色体中。到当前为止，很多研究人员使用

9、这一方式方法制备转基因动物。1976年，Jaenisch1利用逆转录病毒与小鼠卵裂球共培养将莫氏白血病病毒基因插入到了小鼠基因组中。Robertson等5在1986年使用逆转录病毒载体将外源DNA序列引入干细胞系，实现了生殖细胞的整合，得到可遗传的转基因动物。 这种方式方法的优点是：逆转录病毒能感染分裂细胞和静止细胞，不易诱发宿主免疫反响；感染率和整合率高，对技术要求不高；外源基因多属单拷贝整合；宿主范围广等。但这种方式方法也有其缺点，逆转录病毒载体容量有限，要求导入的外源基因大小小于10kb；同时逆转录病毒DNA可能随外源基因一起整合到宿主染色体上；干扰外源基因表示出；逆转录病毒本身存在致癌

10、作用，安全性有隐患；外源基因进入生殖系统较困难，得到的转基因动物大多为嵌合体。 1.2、 DNA显微注射法 显微注射法是制备转基因动物最早使用的方式方法，该方式方法由Gorden等2于1980年建立。这种方式方法利用显微操作技术将外源基因片段直接导入原核期胚或培养的细胞中，而使外源基因整合到宿主的染色体上4。研究人员们用此方式方法成功制备转基因动物。1980年，Gorden等2用显微注射的方式方法获得了转入疱疹病毒胸苷激酶基因的转基因小鼠。1982年Palmiter等3通过显微注射法得到转基因 超级小鼠 。Hammer等4在1985年通过显微注射法获得了转基因兔、羊和猪。 这种方式方法的优点是

11、：对于外源基因的大小没有十分限制；整合率较高。但这种方式方法仍存在缺点，显微注射技术存在一定难度；整合位点较随机，不利于研究基因的详细构造、功能和表示出调控。 1.3 、基因打靶技术 基因打靶技术于20世纪80年代开场发展，基于胚胎干细胞的体外培养和基因改造发展而来。胚胎干细胞是从胚胎中分离得来的原始的未分化细胞，具有分化的多潜能性。胚胎干细胞被注射入囊胚后能够参加受体动物包括生殖腺在内的各种组织的嵌合体的构成，在体外改造胚胎干细胞基因组的经过中，能够使其直接或间接发育成整个个体。这种技术基于同源重组的原理，将外源DNA定点整合到靶细胞的特定基因座上，进而能够对动物基因组进行精细修饰和改造。1

12、981年，Evans和Kaufma等6初次成功在体外培养了小鼠胚胎干细胞，这是基因打靶的技术基础。1987年Thompson等7初次利用基因打靶技术对小鼠胚胎干细胞进行定点诱变，而在随后的1989年，Mario Capecchi、Martin Evans和Oliver Smithies真正意义上获得了第一例基因敲除小鼠8。 这种方式方法的优点是：整合位点专一性较强，能克制随机整合的盲目性；表示出水平高；打靶后目的片段能够稳定遗传。但这种方式方法仍存在缺点，基因打靶的效率太低；产生的串联重复序列稳定性低，可能自发进行二次同源重组；某些基因被敲除后，会对动物产生不良影响，甚至致死；敲除的基因功能往

13、往是未知的，要进一步考虑基因打靶技术优化；当前一些动物的干细胞系没有完全建立好，应用遭到限制。 1.4 、精子载体法 精子载体法在转基因经过中利用精子作为外源DNA导入受体细胞的载体。该方式方法先将成熟的精子与外源DNA进行培养，使精子获得携带外源DNA的能力，将外源DNA带入卵细胞中，完成受精，外源DNA整合到染色体中9。1971年，Brackett等证明受精时可将外源DNA带入卵细胞内10。1989年，Lavitrano等初次利用小鼠附睾精子与DNA温育产生转基因小鼠。随后，以精子为载体的动物转基因方面相关研究陆续展开10。 这种方式方法的优点是：精子与卵细胞之间的自然融合经过可减少人为机

14、械操作而给胚胎带来的损伤；整合率较高。但这种方式方法仍存在缺点，整合不够稳定；不同体系的研究不够充分。 1.5 、体细胞核移植法 体细胞核移植法是将外源基因导入动物体细胞而作为核供体，将核移植到去核未受精的成熟卵母细胞，对其进行激活，再将发育得来的胚胎移入代孕雌性动物进行转基因动物制备的方式方法。1997年Wilmut等11人利用绵羊的乳腺上皮细胞作为核供体，初次培育出了克隆绵羊多莉，这是该方式方法制备转基因动物的代表。1997年7月，英国罗斯林研究所和PPL公司将体外培养的绵羊体细胞进行人凝血因子基因的转染，通过体细胞核移植技术克隆出转基因绵羊波莉9。随后，体细胞核移植法得来的克隆牛、猪等相

15、继获得成功。 这种方式方法的优点是：转基因动物制备效率高；得到的动物个体绝大多数与供核亲本一致，能够保持亲本的优良性状。但这种方式方法仍存在缺点，体细胞的分化程度高，恢复全能性困难；这一技术的经过复杂，对仪器设备要求高；细胞培养的代数有限；得到的家畜作为食品的安全性问题存在争议。 2、 转基因动物的应用 转基因动物技术发展到如今，应用方面已深切进入到生物科学、构建疾病模型、治疗疾病、动物生产等很多方面。 2.1 、生命科学研究方面的应用 实验室中，转基因动物技术为生命科学领域的研究提供了适宜的研究材料。利用转基因动物技术，对研究对象的基因进行敲除和过量表示出等，能够研究相关基因的结果、表示出、

16、功能和调控。例如，基因敲除的动物模型对于蛋白质生理功能的研究提供了很大的帮助。水通道蛋白家族于1989年被发现，Verkman、麻彤辉和杨宝学等学者利用十几年的时间构建出一系列水通道蛋白基因敲除小鼠，研究水通道蛋白在尿浓缩、消化液、脑脊液代谢等经过中的生理功能12。类似的研究还有很多，转基因技术已成为生命科学研究领域内的重要工具。 2.2、 人类疾病模型方面的应用 当前研究人员对很多人类疾病的机理并不清楚，贸然在人体上进行相关实验牵涉到安全和伦理等问题。建立相关人类疾病的动物模型则为这一问题提供了解决方案。利用动物转基因技术来构建相关人类疾病的动物模型能够解决自然突变和人工诱变带来的突变率低以

17、及突变方向难控制的问题。很多研究人员已经成功构建相关人类疾病的动物模型。例如，阿尔兹海默症模型APP/PS1转基因小鼠的建立，这种过量表示出型转基因小鼠如今是世界范围内广泛使用的评价这一病症药物和治疗疫苗的动物模型。贫血病转基因小鼠的建立，为研究分析贫血病的发病机制、药物治疗效果提供了重要的动物模型。再如，表示出人类原癌基因的转基因兔也已经被广泛应用于人类肿瘤发生机制、寻找有效预防和治疗措施的研究。而糖尿病和心血管疾病转基因猪模型也有较多报道。当前，多种疾病的转基因动物模型已经建立，为这类疾病的研究提供了方便13。 2.3 、异种器官移植方面的应用 如今有很多疾病牵涉到器官衰竭问题，医学工作者

18、们也渐渐采用器官移植作为治疗手段，为患者们提供了良好的治疗方向。然而器官移植这样的方式方法除了对施行手术的医生的医术以及手术技术有高要求以外，器官来源的短缺是如今面临的重要问题。有很多病人在等待器官来源的经过中死亡。在这种情况下，异种器官移植被科学家们提了出来。应用于人体疾病的异种器官移植利用手术的方式方法将某种动物的器官或组织移植到人体的某一部位。为了克制人体对异种器官的免疫排挤，科学家们选择对动物的器官进行人源化修饰和改造，利用转基因动物技术培育出基本不使人体发生免疫排挤的克隆动物。猪的器官大小、构造和功能与人体器官相近，是人体器官移植的最佳材料。固然当前的研究尚未到达临床阶段，异种器官移

19、植也面临着猪内源性病毒的对人体产生跨物种感染的风险，但利用动物转基因技术对异种器官移植继续进行研究对人类仍具有重大意义。 2.4、 动物品种改进方面的应用 在动物生产方面，生产人员希望很多具有优良性状的动物个体的优良性状能够得到保存并扩大生产，同时希望对一些动物品种进行改进。传统的动物品种改进只能依靠亲缘关系近的物种间的自然突变，而自然突变在自然界中的发生频率极低。动物转基因技术能够克制传统动物品种改进技术的缺乏，加快改进进程、创造新的突变、打破物种间基因沟通的限制。在经过动物转基因技术，能够对动物进行基因改造，以此来将优良性状调高，提高动物的经济和营养价值。这些优良性状包括：抵抗疾病和抵抗病

20、原微生物的能力、动物较高的产奶量、高质量的肉类、较高的繁衍能力以及动物生长周期的缩短等。当前动物转基因技术已在这方面获得一些成功应用。例如，1998年，美国农业部的研究人员成功获得了促生长转基因猪胰岛素样生长因子。该促生长基因的导入，显着改变了猪的产肉性能，猪肉脂肪含量减少10%，瘦肉含量增加6%8%，显着提高了猪的经济性能。再如，2008年，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所等单位，通过克隆和基因重组技术，成功制备了转基因猪，该转基因猪与普通猪相比，在肌肉和脂肪中不饱和脂肪酸的含量显着提高。不饱和脂肪酸为有益人类健康脂肪酸，能使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯，降低血液黏稠度，改善血液微循

21、环，提高脑细胞的活性，加强记忆力和思维能力。 2.5、 食品药品生产方面的应用 有研究人员抱希望于通过相关研究在人类的食品 动植物体内含有可治疗疾病、强身健体的保健品和药物等。20世纪20年代，从猪胰腺中提取的胰岛素开场被用作药物。20世纪80年代初，人类用重组细菌制备了胰岛素，如今所有糖尿病患者都在使用。其他几种蛋白质，尤其是人类生长激素，也是由细菌合成的，但细菌不能合成复杂的蛋白质，如单克隆抗体或凝血因子，这些蛋白质必须经过翻译后的修饰主要包括折叠、分裂、亚单位结合、 -羧基化和糖基化才能在体内激活或稳定。而这些修饰能够发生在哺乳动物细胞中。如今通过动物转基因技术，对动物进行基因工程方面的

22、改造，能够使动物生产重组蛋白如包括单克隆抗体、疫苗、血液因子、激素、生长因子、细胞因子、酶、乳蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白原等。如运用转基因技术能够将编码药用蛋白的外源基因导入雌性家畜的体内，使其在家畜的乳腺中特异性表示出出相应的药用蛋白，实现动物 生物反响器 的功能。 3 、转基因技术中的问题 转基因效率低是动物转基因技术发展到如今面临的重大问题之一。 在动物转基因技术的施行经过中，转基因大部分的表示出水平较低，给检测和转基因动物的制备带来困难。 利用胚胎干细胞来进行的动物转基因技术中，限制技术施行的一个重大问题就是胚胎干细胞培养的难度问题。 转基因动物的制备在很多方面得到应用，给人类带来福音，

23、但其安全性问题也令人担忧。转入的基因可能会给动物带来病毒，转基因动物器官的移植会像人体传播 人畜共患病 ；使用转基因动物生产的食物和药品可能会给机体带来过敏反响；转基因动物的研究存在相关伦理问题等。 4、 瞻望 动物转基因技术发展到今天，已经历经了几十年的历史，在这几十年中，动物转基因技术日趋成熟，新的方式方式方法不断出现。通过这些方式方法可人为地改造实验动物的基因组，为研究其相关基因的构造与功能提供了新方式方法以及新思路。这些方式方法各具其特点，各有各的优点与限制，它们的不断出现、改良以及具备的重大应用意义，也使得转基因动物以及转基因技术成为生命科学研究的重要领域。 当前的发展趋势表示清楚，

24、动物转基因技术和转基因动物的制备在生物科学领域内具有较高的研究价值，领域内也已经掀起了相关研究的热潮，这是如今特别具有应用价值的研究内容之一。 固然如今转基因动物技术还在不断完善和革新的经过中，很多方面的应用尚未进入最终的产业化阶段，但随着理论和技术不断向前推进，动物转基因技术和转基因动物的制备必将对人类的疾病治疗、生产生活、社会发展等方面产生宏大的影响。 以下为参考文献 1Jaenisch R.Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virusJ.Proceeding

25、s of the National Academy of Science,1976,73(4):1260-1264. 2Gordon JW,Scangos GA,Plotkin DJ,et al.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNAJ.Proc Natl Acad Sci USA,1980,77(12):7380-7384. 3Palmiter RD,Brinster RL,Hammer RE.Dramatic growth of mice that develop from eggs

26、 microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genesJ.Nature,1982,300(5893):611-615. 4Hammer RE,Pursel VG,Rexroad CE Jr,et al.Production of transgenic rabbits,sheep and pigs by microinjectionJ.Nature,1985,315(6021):680-683. 5Robertson E,Bradley A,Kuehn M,et al.Germ-line transmission of ge

27、nes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vectorJ.Nature,1986,323:445-448. 6Evans M J,Kaufman M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryosJ.Nature,1981,292:154. 7Thomas K R,Capecchi M R.Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-deriv

28、ed stem cellsJ.Cell,1987,51(3):503-512. 8秦川揭示基因组功能的强大工具：基因打靶技术 2007年度诺贝尔生理学或医学奖成果简介J科技导报，2007(24):30-35. 9冯登侦，陈泽明，冯梅秀动物转基因技术及其研究进展J宁夏农学院学报，2003,24(2):72-75. 10徐海平，张细权转基因技术在鸡的抗病育种中的研究应用进展J养禽与禽病防治，2005(9):4-7. 11Wilmut I,Schnieke A E,McWhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cellsJ.Nature,1997(385):810-813. 12王傲雪基因工程原理与技术M高等教育出版社2021:241-260. 13张贺，王承利，王洋转基因动物研究进展J动物医学进展，2008,29(7):59-62.