胰酶对猪腹泻病毒S蛋白作用的最新成果综述,病毒学论文.docx

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1、胰酶对猪腹泻病毒S蛋白作用的最新成果综述,病毒学论文猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒porcineepid emicdiarrhea virus,PEDV引起的一种以仔猪腹泻、呕吐和脱水为主要临床异常感觉和状态，最终毁坏电解质平衡导致病猪死亡的的一种急性腹泻病1.PEDV属套式病毒目，冠状病毒属，有囊膜，囊膜上包裹着花瓣状的纤突。其基因组为不分节段的单股正链RNA病毒，大小在2830kb,由七个开放阅读框ORF编码三个非构造蛋白ORF1a、ORF1b和ORF3，四个构造蛋白：S蛋白纤突蛋白、E蛋白小膜蛋白、M蛋白膜糖蛋白和N蛋白核蛋白。华而不实，S蛋白在病毒的融合机制、组织嗜性和致病性等多方面

2、发挥重要作用。然而本次流行毒株S基因多引入9个碱基的变异，致使新型毒株大范围流行，对于PED新毒株的分离，再次成为焦点问题。当前，研究发现胰酶在PEDV分离中被广泛应用，由于胰酶可裂解S蛋白，使其在体外感染Vero细胞，并且随着胰酶的浓度增加PEDV感染效果越明显2.而胰酶在PEDV分离中与S蛋白的作用机制仍然不是很清楚明晰，本文将通过介绍胰酶对S蛋白作用的最新研究进展，为以后新型PEDV分离和疫苗研究提供参考。1PEDV的变异及传播1971年PED初次在英国报道，随后普遍达到欧洲和亚洲各国。2018年以后PEDVS基因S1区N端碱基出现15个碱基插入和6个碱基缺失，比对发现这些突变区碱基多为

3、T和C的相互转换。该毒株随后流行于中国、韩国、泰国和日本等国家。然而，现有疫苗株CV777与其同源性为96.9%,导致疫苗防治无效3.2020年美国23个州爆发疫情，2020年德国报道PED的流行，且流行毒株与变异毒株同源性更高层次4-5.PEDV变异毒株的出现，导致大量仔猪的死亡，使其成为业界关注的热门。PEDV的变异很可能与冠状病毒的S蛋白进化性有很大联络，是冠状病毒适应新环境所产生的进化。同为冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒PRCV-ISU-1株也在S蛋白的N端有227氨基酸的缺失，进而改变了该病毒的组织嗜性6.Gao等发现流行我们国家华东和华北的流行毒株与与韩国毒株更类似，而南方地区的毒株

4、又与泰国流行毒株关系更近7.泰国学者也曾分析发现，新型PEDV爆发的很大原因来自猪肉和骨粉等原料的进口，进而使病毒在泰国传播8.同样在美国爆发疫情后，墨西哥和加拿大也随即出现该病的报道，因而这种地缘位置和经济贸易，可能是该病传播的重要途径。2S蛋白及其功能S蛋白也称纤突蛋白，即类冠状病毒融合蛋白，主要负责病毒的吸附和融合。S蛋白由4152个核苷酸编码1383个氨基酸组成，被分成N端S1区1789氨基酸和C端S2区7901383氨基酸，S1区主要作为受体，S2是膜融合的功能区9-10.S2区又分为三个亚区，包括胞外区、跨膜固定区TM、胞质尾区CT。胞外区有胰酶切割位点，S1和S2共同作用促进PE

5、DV感染细胞，而这个感染经过需要在胰酶的辅助下完成。S基因的胞外区也是病毒粒子的毒力基因，然而最近几年世界流行的毒株几乎全部在S基因N端170171bp位点插入CAGGGTGTCAAT和413414bp插入ATA共计15个碱基并在479480bp缺失TGGGGAA.通过比对发现S基因有198个左右核苷酸发生突变，华而不实发生在S1区内突变占73.3%.SunR等学者将2018-2020年我们国家分离到PEDV流行株的S基因与2018年以前的毒株进行序列比对，发现新分离的毒株在S基因也在一样位点发生了15个碱基的插入和6个碱基的缺失。这种变化可能潜在的改变了PEDVS基因抗原性，由于PEDV抗原

6、中和表位COE499-638aa存在S基因内11.日本学者报道过的83p-5毒株在传代的经过中，发现34代和61代出现的18个碱基变化在100代仍存在，致使83p-5株S蛋白信号肽、S1和S2的膜外区发生突变，导致该毒株对仔猪致病性减弱12.综上可知，病毒毒力的改变和S基因上的碱基变化有很大联络。而近年流行的变异毒株与疫苗CV777株相比，在S基因N端共计多出9个碱基的变化，使S蛋白上的糖基化位点、毒力基因、细胞培养特性和跨膜螺旋都发生了变化13.因而S基因的变异情况更能具体表现出PEDV的整体变化情况。S蛋白作为类融合蛋白在感染经过中尤为重要，它是冠状病毒膜融合进入细胞的功能蛋白，S蛋白经胰

7、酶等处理，可转变为膜融合蛋白14.通过胰酶裂解的S蛋白易发生构象改变促进膜融合。我们国家学者使用LJB/03毒株对猪氨基肽酶NpAPN转染到MDCK细胞中表示出，发现S蛋白能与猪小肠上的pAPN发生受体结合，并证实pAPN为PEDV的感染性受体15.这个结合经过很可能是胰酶把S蛋白裂解成S1和S2两个构造域，S1辨别细胞外表受体pAPN,激活信号肽上的酪蛋白激酶磷酸化位点，S2区在刺激下执行S蛋白的构象转化与细胞膜发生融合16.但是pAPN受体是不存在Vero细胞上的，所以很可能PEDV感染细胞不只是通过这一种途径或者有不同的功能性受体。2018年以后由于S基因共计9个碱基在S1区的插入，可能

8、潜在的改变了PEDV对细胞的适应性和胰酶促进PEDV融合的位点。3胰酶对S蛋白的作用3.1胰酶改变S蛋白构象PEDVS蛋白具有类融合蛋白所具有的共同特征包括融合蛋白N端一样的融合肽位点和C端以螺旋形式包围的三螺旋构造，进而使S蛋白构成一种亚稳的三聚体形式存在。病毒的这种构造，在特定因素的刺激下就会与受体发生融合17.因而大多数病毒的分离都需要借助胰酶的作用，例如禽流感病毒、人冠状病毒229EHCoV-229E、非典型肺炎SARS-CoV、鼠肝炎病毒MHV和PEDV等18-19.Kazuya等报道PEDV在体外感染Vero细胞时只要存在胰酶样物才能构成多核体，促进细胞间融合20.而在缺少外源蛋白

9、酶的情况下，PEDV可以通过胞内体途径并利用内源组织蛋白酶激活S蛋白进行膜融合。冠状病毒一般利用S蛋白的融合作用进入细胞，通过囊膜与细胞膜融合和胞吞两种途径。然而病毒感染细胞经过是需要利用胰酶改变S蛋白的构象促进病毒与细胞发生融合。首先病毒上的融合蛋白诱导病毒与靶细胞的融合，结合作用后暴露融合肽使靶膜与细胞膜严密接触，这时融合肽周围的脂质分子进行重排，最后通过中间体过度发生融合。而胞吞机制被以为是pH敏感的经过，但是直接的膜融合是不依靠pH值17,21-22.研究证明HCoV-229E通过胰酶和组织蛋白酶L的裂解后，可有效的促进膜融合，这种感染经过与SARS-CoV侵入细胞是有共同特征的23.

10、Matsuyama证实冠状病毒的S蛋白经过两次构象的变化，并在胰酶介导下可发生膜融合。通常是由于S蛋白含有特征性的保守七肽重复区HR，包括HR-C和HR-N.病毒在融合经过中HR-N常构成一个内部的三聚体卷曲螺旋构造与三个HR-Cs以反并联的方式结合，最终构成六螺旋体6HB，这种构造易与细胞膜贴近利于膜融合的发生24.最新研究显示，发现真实的六螺旋体直接在细胞膜上耦合构成，愈加暗示着通过六螺旋体的构造促进病毒与细胞的融合25-27.PEDV融合机制完全与同类冠状病毒感染的经过是一样的，它们都是通过胰酶作用改变S蛋白构造，使病毒构成易于融合的六螺旋体构造，促进病毒感染14.3.2胰酶触发S蛋白的

11、融合机制冠状病毒是囊膜病毒，它的融合经过可利用多种途径。例如在受体结合后可利用酸性环境或胰酶水解激活S蛋白，进而使融合肽与靶膜融合，这个经过都是由S蛋白调控的28.Judith等学者根据构造标准确定了四种不同的激发病毒融合蛋白通过构象变化的机制，但是各种病毒融合蛋白都经历 完全融合 嵌膜的同源三聚体发卡前体 三聚体发卡也称作六螺旋体 等一样的构造转化，最终促进病毒与细胞膜融合29.Shutoku也曾报道病毒融合多采用两步法，受体在中性pH时被激活，随后通过酸性环境完成膜融合。所有类融合蛋白在病毒外表就以一种亚稳的三聚体形式存在，这种构造通过跨膜区固定在病毒的囊膜上，经过酸性环境诱变亚稳三聚体即

12、转换成发夹前构造中间体，暴露融合肽与细胞膜双分子层结合21.然而冠状病毒S蛋白转化成六螺旋体构造，是需要利用胰酶裂解完成的，由于有学者研究发现PEDV胰酶分离株CV777相比细胞适应株DR13培养无需胰酶在胰酶裂解后S蛋白的S2 位点保存一个精氨酸R残基，而DR13该位点的R突变为甘氨酸G，但是大多数冠状病毒的S2 位点是R,这样就能够合理解释为什么DR13能够不依靠胰酶培养30.结合以上研究发现，即便不同的病毒融合经过有略微的区别，但是通过胰酶或者酸碱度作用后都会构成稳定的融合构造。这就预示病毒具有一样的融合构造，而冠状病毒作为最大的RNA病毒需要胰酶的刺激才可构成六螺旋体，是由于S蛋白S2

13、 位点R的存在，而胰酶成为触发这种构造变化的关键因素，所以PEDVS蛋白通过胰酶裂解才可发生构象改变。3.3胰酶促进PEDV感染细胞大多数冠状病毒都能够诱发体外感染的细胞发生细胞间的融合，Hingley报道冠状病毒MHV-2在感染细胞时，经胰酶处理能够观察到合胞体的构成31.有研究证实PEDV和牛冠状病毒接种细胞同样在胰酶处理下，可观察到多核体的构成。但是PEDV感染细胞构成合胞体，只要在胰酶处理后才能够观察到明显的细胞病变。而不经胰酶处理PEDV是不能有效的在培养细胞中增殖，构成细胞病变17,32-33.这是由于PEDV进入细胞时，胰酶会使S蛋白构成易于融合的构象，加强病毒对Vero细胞吸附

14、，促进融合活动的发生。随着病毒感染并增殖，邻近的细胞发生互相融合，构成细胞病变。Park报道利用10 g/mL胰酶在接种前分别对PEDV、Vero细胞进行预处理10min和在接种后立即参加胰酶，PEDV感染的效果不同。在对细胞和病毒分别预处理不会增加病毒的滴度，然而在接种时参加胰酶会明显使病毒浸透到细胞内。胰酶只会在PEDV吸附细胞时，诱导膜融合的发生，增加病毒的感染34.因而在对PEDV分离经过中把握适宜胰酶处理的时间段会影响病毒的有效分离。有研究表示清楚分别利用胰酶和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2处理接种PEDV后的Vero细胞病毒滴度明显增高，而且能构成明显的多细胞融合体，Shirato学者

15、曾利用病毒已经感染的Vero细胞在无胰酶的条件下，培养3d后短暂的参加胰酶发现感染的病毒立即从细胞外表释放到培养液，经实验证明是外源的胰酶提高细胞培养液中病毒的滴度，显示胰酶才是使病毒从感染的细胞中释放的关键因素20,28.由于PEDV感染的细胞上没有蛋白酶的存在，病毒粒子在感染的细胞外表以簇或聚集体的形式存在，通过随后的胰酶处理才使病毒粒子释放到细胞培养液中35.这种现象表示清楚是胰酶的作用，使病毒有效的从细胞中释放。胰酶的这种作用与神经氨酸酶NA促进禽流感病毒从感染的细胞外表上受体释放的经过是一样的36.胰酶的这些作用非常有助于PEDV的分离和其致病机制的研究20.在动物体内内源性蛋白酶如

16、弗林蛋白酶、质膜蛋白酶和内溶酶体蛋白酶等，都能有利于PEDV的S蛋白裂解，促进其感染肠上皮细胞28,37.PEDV在体外分离需要借助胰酶的修饰，其实是模拟体内感染经过中病毒粒子借助内源性蛋白酶的作用感染靶细胞。在PEDV的繁衍经过中胰酶是病毒感染和释放所必需的，日本学者通过长满单层Vero细胞的24孔培养板中，使用MK毒株接种，并设置了存在胰酶和无胰酶的两种条件，接种后用PBS代替培养液，检测发如今胰酶存在条件下PEDV的滴度是无胰酶的1000倍左右。随后又分别把已经感染病毒的Vero细胞，用无胰酶的培养液在37温箱中培养三天，弃掉培养液利用PBS冲洗2次，在室温用胰酶处理5min.通过荧光定

17、量PCR检测发现胰酶处理后的培养液病毒浓度明显比不经胰酶处理的高20.所以PEDV野毒株分离培养是严格需要体外的胰酶处理，病毒才会有效的感染细胞，促进病毒的增殖和加快细胞病变的构成，最终胰酶使病毒粒子从细胞外表释放。总之，胰酶在病毒感染和释放中的一系列作用，暗示其在PEDV野毒株分离经过中扮演至关重要的角色。同时这可能预示着体内蛋白酶会使PEDV介导的腹泻感染加重。假如是这样，对于PEDV的防控，蛋白酶抑制剂会是一种理想的治疗药物。4胰酶在PEDV分离中的应用PEDV从开场流行经历了十多年的时间Hoff-man等通过利用Vero细胞在胰酶存在的条件下培养出PEDV38.然而至今，仍然没有稳定分

18、离培养的方式方法。多数学者都是尝试利用在培养液中参加胰酶，通过上述胰酶可促进构象变化的作用分离病毒。当前多采用Vero细胞作为病毒分离的宿主，由于它能抵抗高浓度胰酶的作用，同时知足PEDV感染对胰酶的需求。Kadoi等学者在PK、ST、CPK和ESK等细胞在培养液中添加胰酶成功培养了PEDV,并能够产生明显的细胞病变39.Liu等报道PEDV通过在细胞培养液中参加5 g/mL胰酶，成功的在人源细胞系Huh-7,MRC-5生长并能产生明显的CPE40.2020年美国学者通过在培养液参加5 g/mL胰酶利用Vero细胞也成功的分离出两株新型PEDVISU13-19338E和ISU13-220384

19、1.因而，能够通过试验的目的和说明的问题，选择PEDV适应的细胞系且结合胰酶的作用，找到PEDV野毒株稳定分离培养的方式方法。5结束语上述资料表示清楚，当前研究已经证实胰酶通过裂解PEDVS蛋白使其构成易于融合六螺旋体构象，这个胰酶结合位点是在S2 的精氨酸残基。随着病毒的增殖，胰酶又可促进病毒从感染细胞中释放，结合胰酶一系列作用可表示清楚胰酶是PEDV体外融合、感染和释放的关键因素，且结合其体内和体外一样的感染机制，也为PEDV积极防治提供了新思路。通过对胰酶在病毒分离培养中作用的研究进展，胰酶很可能是通过如下机制发挥作用：胰酶裂解PEDVS蛋白激活信号肽通路，促使S1和S2与细胞膜受体结合发生细胞膜重排，产生易于感染细胞的六螺旋体构造；胰酶作为一种标准的丝氨酸肽链内切酶能与被裂解的冠状病毒S蛋白上具有S2 精氨酸残基的功能性受体结合，进而促进融合反响的发生。希望在以后的研究中能最终揭示这一反响机制。