快速检测中多重PCR技术的运用和优势,生物化学论文.docx

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1、快速检测中多重PCR技术的运用和优势,生物化学论文摘 要： 多重PCR技术是一种将常规PCR扩增体系改良后同时扩增加个目的片段的新型技术。多重PCR凭借高通量、低成本、特异性强的特点,迅速被应用于快速检测领域及科学研究领域。扼要概述了多重PCR技术,综述了多重PCR技术在病毒检测、细菌检测、血清学检测的应用,并将其与常规技术进行比拟,总结了这些方式方法的优缺点,为今后多重PCR技术在快速检测中的应用选择提供根据。 本文关键词语： 多重PCR; 血清学; 细菌; 病毒; 快速检测; Abstract： Multiplex PCR technology is a new technique to

2、amplify multiple target fragments at the same time after optimizing and improving the amplification system of conventional PCR. Due to its high throughput,low cost and high specificity,multiplex PCR has attracted much attention in the field of rapid detection and scientific research. This article br

3、iefly outlines the application of multiplex PCR in virus detection,bacterial detection and serological detection. We compare the advantages and disadvantages between the common methods and multiplex PCR and summarize the application and prospect of multiplex in rapid detection. Keyword： multiplex PC

4、R; serology; bacteria; virus; rapid detection; 多重PCR又称复合PCR，是在常规PCR基础上改良并发展起来的一种新型PCR扩增技术，即在同一个反响体系中参加两对以上引物，同时在同一模板或不同模板之间进行多个核酸片段的扩增。与常规PCR相比，多重PCR技术拥有单个PCR灵敏性和特异性，又较之快速和经济，在引物和PCR反响条件的设计方面表现出很大的灵敏性。自Chamberlian和Gibbs等人于1988年初次报道通太多重PCR扩增挑选出杜氏肌营养不良基因座的缺失以来1，多重PCR技术已被成功应用于基因诊断的多个领域，包括临床病原微生物检测2、食品安

5、全的检测3、植物基因分型与定量研究4和肿瘤用药指导5等研究。 随着社会需求的扩大，检测鉴定已不局限于传统检测手段，随着分子生物学检测的崛起，快速检测已成为当前安全检测、检验检疫等领域中的重要组成部分，十分是在全球新冠疫情的影响下，快速检测为社会提供了高效便捷的服务，而利用一次多重PCR反响，可同时检测、鉴别出多种病原体/基因型，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值。本文分析了多重PCR在快速检测中的研究进展与应用热门，为完善快速检测手段及应用选择提供参考思路。 1 、多重PCR原理 多重PCR技术是在常规PCR的基础上加以改良后的一种新型技术，其基本原理与常规PCR一样，是

6、通过聚合酶链式反响来到达目的片段的扩增。当DNA双链处于90高温时，双链DNA会解旋成单链DNA;当温度降到60左右时，引物与特定的靶序列相结合;当温度升到72时即为DNA聚合酶的最适温度，在依靠多种d NTPs底物的基础上再通过碱基互补配对原则进而完成单链DNA的延伸工作，最终完成DNA双链的合成6。多重PCR与常规PCR的区别在于同一个反响体系中所参加的引物对数不同。多重PCR能够特异性扩增出一条以上的目的DNA片段。反响体系的组成和PCR循环的条件需要经过优化以确保同时扩增加个DNA片段。理论上只要PCR扩增的条件适宜，引物对的数量能够不限，但由于各种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量

7、是有限的(1000对)。 2 、多重PCR技术在快速检测中的应用 快速检测是指样品制备简单、所用试剂较少、制备后可保存较长时间、操作经过简单、对操作人员要求较低，且能在较短时间内完成检测分析并得出检测结果的方式方法7。快速检测可快速筛查任何存在问题的产品，能及时发现问题并采取相关措施，以此可避免食品安全事件的发生或生产企业的损失，这对提高监督工作效率和力度，保障社会卫生安全具有重要意义。常用的快速检测方式方法除了当前有关核酸检测中用到的多重PCR技术以外，还有胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法、电化学分析法等7。 当前，多重PCR技术在快速检测中的运用较为广泛，在不同的领域之间也有相关的研究报道

8、。表1总结了近年来部分研究情况，华而不实，多重PCR技术在细菌检测方面的应用相对较多。 2.1 、在病毒检测中的应用 病毒是一种个体微小，构造简单并且必须依靠宿主细胞进行增殖的非细胞型生物，同时具有在生物体之间进行传播并感染生物体的能力。一旦感染上有害病毒如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、新型冠状病毒等，则会给人类带来疾病甚至威胁生命。多重PCR技术的应用给病毒检测带来便利。张曼等建立鉴别禽流感病毒、新城疫病毒和安卡拉病毒的多重PCR检测方式方法17;刘晓萌等采用多重PCR技术检测支气管异物并下呼吸道感染患儿病原菌，病原菌检出率为96.2%，其结果的病原体检出率与分离培养相比，远远大于分离培养的病

9、原菌检测率41;蔡德丰等使用多重PCR对大肠埃希菌、副溶血弧菌、痢疾志贺菌、肠炎沙门菌及肠道病毒71型腹泻病原体进行检测，结果各样本之间无穿插反响，各腹泻病毒Adv、No V G1、RV A、SV及HAst V的检出限均小于5 103copies/ L,No V G1小于1 104copies/ L，表示清楚该技术的特异性和灵敏度都很高10。 2.2 、在细菌检测中的应用 细菌检测中，最为常见致病菌主要包括致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌属的类群(Shigella)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostrid

10、ium botulinum)等。多重PCR技术在细菌检测中应用广泛，白龙等通过优化多重PCR技术，用于检测在多种鸡源细菌中的5种四环素耐药基因42;谢庆超等构建多重RT-PCR体系检测了92份生食水产品样品的副溶血性弧菌和单增李斯特菌32;李新福等通过优化多重PCR技术的反响条件检测出低温肉制品中的沙门菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球31，其检测结果具有高特异性及高灵敏度的特点，操作也省时省力，为快速检测提供高效便捷的参考办法。 2.3、 在血清学检测中的应用 即便是一样的细菌，不同的血清型给人带来的影响也会不一样。例如大肠埃希氏菌、沙门氏菌，不同的血清型在侵袭力、耐药性、毒素系统以及给出的治疗

11、方案也不一样。郑玉玺等建立对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测的多重PCR方式方法37;左乐等通过建立多重荧光PCR鉴定体系同时检测了常见的15种沙门菌血清型，其方式方法检出限为1.1 10-31.2 10-3ng/ L，检测灵敏度到达1 pg/ L，从核酸提取到结果断定，整个实验经过可在1.5 h内完成42，这具体表现出了多重荧光PCR技术较高的特异性、省时省力的特点。 表1 多重PCR技术在快速检测中的应用情况 3 、多重PCR在快速检测中的优势 标准检测法、常规PCR与多重PCR技术都是在快速检测中广泛应用的方式方法，这三类方式方法的比拟见表2。华而不实，标准培养检测方式方法需要增菌、

12、划线培养、染色镜检、平板计数等操作，步骤较多、耗时较长，一般需要57 d，但成本较低，操作相对简单。常规PCR方式方法较标准检测法检测速度提升、操作更简便，且特异性强，但由于提取方式方法的受限可能会造成假阴性，或死菌DNA的污染易造成假阳性，成本较高，另外还需要PCR仪及凝胶电泳的使用。多重PCR方式方法优势突出，比常规PCR方式方法操作更为简便，大大缩短了检测时间，且试剂耗材少。 表2 标准检测法、常规PCR与多重PCR的比拟 4 、结论与瞻望 近年来，随着快速检测的需求越来越大，分子生物学的检测技术也更为广泛地应用，多重PCR技术作为华而不实便捷的分子生物学手段，由于其具备有高效率、低成本

13、的特点，在快速检测中获得很大的关注，至今已有大量的研究报道。但多重PCR技术仍有些缺乏之处，一是随着检测重复次数的增加，扩增效率的一致性可能会被降低;二是降低相应引物浓度时，可能会引起假阴性的结果;三是易遭到样品中死菌DNA的污染，进而导致假阳性的情况发生，华而不实，扩增效率的一致性是多重PCR技术广泛运用的一大难题。除此之外，多重PCR技术也具备有其他方面的优势，高通量，是它最显而易见的特点，一次操作便可扩增出不同的病原体或不同的目的条带。即节省了时间，也节省了成本。将来可在现有的研究基础上将多重PCR技术与其他技术相结合，例如将膜层析技术与多重PCR技术相结合45，由于膜层析具有分离混合液

14、的特点，与多重PCR技术相结合后可解决检测结果假阳性的问题或其他相关问题。除此之外，还可研发一种便于携带且操作简便的检测试剂盒，让检测技术不在局限于实验室，能够随时随地检测，到达实时检测的目的。 (本文文献格式:官昭瑛，李慧敏，何曼文，等多重PCR技术在快速检测中的应用J山东化工，2021,50(3):85-88.) 以下为参考文献 1CHAMBERLAIN J S,GIBBS R A,RANIER J E,et al.Deletion screening of Duchenne muscular dysrtophy locus via multiplex DNA amplificationJ

15、. Nucleic Acids Res,1988,16(23):11141-11156. 2 施卓君.多重PCR技术在病原微生物检测中的应用J.医学美学美容旬刊,2021,24(6):713-713. 3董蕾,黄晓波,刘静璇.多重PCR技术在食品检测中的应用与瞻望J.安徽农业科学,2020,48(11):15-18. 4任素贤,艾鹏飞,宋层孝,等.多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展J.安徽农业科学,2021,43(6):93-95. 5张寒,郑胡镛.一种新型多重PCR技术在肿瘤研究中的应用J.转化医学研究(电子版),2020,4(3):48-57. 6姚栋,张如胜,欧新华.多重PCR快

16、速检测3种致泻性大肠埃希菌方式方法的建立J.国际检验医学杂志,2021,36(8):1032-1033. 7林伟琦.食品安全快速检测技术的应用研究进展J.食品安全质量检测学报,2020,11(3):961-967. 8李乃哲,李阿茜,李建东,等.北美洲流行汉坦病毒多重荧光定量RT-PCR检测方式方法的建立J.病毒学报,2020,36(4):617-623. 9俞燕,周生,李建梅,等.A、B、J和K亚群禽白血病病毒多重PCR检测方式方法的建立及应用J.中国预防兽医学报,2020,42(5):462-468. 10蔡德丰,陈运生,朱纯青,等.多重PCR-毛细管电泳检测儿童5种腹泻病毒的方式方法建立

17、及应用J.临床检验杂志,2020,38(1)15-18 11蒋素华,牛苏燕,梁芳,等.甘薯病毒多重RT-PCR检测方式方法的建立J.分子植物育种,2020,18(9):2957-2962 12胡天,卓永光,樊祖茜,等.沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型多重荧光定量PCR检测方式方法的建立及其应用J.分子诊断与治疗杂志,2021,10(6):385-389. 13王睿敏,施创始,黎宗强,等.猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RTPCR检测方式方法的建立J.中国兽医科学,2022,49(2):190-198. 14聂福平,王昱,刘念源,等.羊痘病毒

18、属病毒多重Taq Man MGB荧光定量PCR检测方式方法的建立J.中国预防兽医学报,2021,40(11):1031-1036. 15赵世恒,王吉腾,李雪娇,等.3种核果类果树病毒多重PCR检测方式方法的建立与初步应用J.北方农业学报,2021,46(3):37-41. 16牛培华,陆柔剑,蓝佳明,等.中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立J.病毒学报,2021,32(3):349-354. 17张曼,韩飞.AIV、NDV和安卡拉病毒多重PCR检测方式方法的建立及应用J.西北农林科技大学学报(自然科学版),2021,46(2):1-6. 18黄元,袁淑英,黄武,等.小反

19、刍兽疫病毒、A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方式方法的建立J.广东畜牧兽医科技,2022,44(3):44-47. 19杨梦婕,任佳,李洋,等.Ge XP多重聚合酶链式反响法检测5种常见食源性致病菌J.中国食品卫生杂志,2020,32(4):386-390. 20李婷,周景瑞,姜玲玲,等.三种鸡源致病性细菌多重PCR检测方式方法的建立J.上海畜牧兽医通讯,2020(4):2-5. 21张昕杨,李火明,夏颖,等.肠出血性大肠杆菌O157多重PCR检测方式方法的建立J.中国预防兽医学报,2020,42(4):360-365. 22毕晓琼,高菡,郭倩,等.三种猕猴桃根腐病致病菌多重

20、实时定量PCR检测技术的建立及应用J.微生物学通报,2020,47(1):311-321. 23袁梦,李马超,胡鹏威,等.肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方式方法的建立和应用J.疾病监测,2020,35(4):340-344. 24吴许文,温旺荣,李沛樟,等.建立检测血液中EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方式方法J.国际检验医学杂志,2022,40(1):19-24. 25胡稳妥,王娉,张彩霞,等.5类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方式方法的建立J.食品科学,2021,39(22):249-255. 26王晓.多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌J.食品安全质量

21、检测学报,2021,9(22):5917-5921. 27杜琳,王丽芳,姚一萍,等.生鲜乳中布鲁氏杆菌多重PCR检测方式方法的建立J.黑龙江畜牧兽医,2021(9):211-213. 28朱新贵,田亚平,王亚珊,等.猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌双重及多重PCR检测方式方法的建立J.黑龙江畜牧兽医,2021(8):75-78. 29曾皎箭,王蒋丽,马合金,等.多重荧光PCR法与细菌培养法在食品中致泻性大肠埃希氏菌检测中的应用J.医学动物防制,2021,34(3):303-305. 30胡翀,马薇,张可昕,等.多重PCR方式方法快速检测血流感染10种常见病原菌方式方法的建立与应用J.中华医院感染

22、学杂志,2021,28(7):961-965. 31李新福,王周平,李聪,等.低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反响快速检测方式方法的建立J.肉类研究,2021,31(2):45-50. 32谢庆超,李想,赵勇,等.多重RT-PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况J.检验检疫学刊,2021,27(4):1-5. 33杨秀茳,郭晓苑,文霞,等.多重PCR快速检测化装品中三种致病菌的研究J.工业微生物,2021,46(4):53-57. 34刘芳,陈国培,王远洋,等.应用多重实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌毒力基因J.食品工业科技,2021,39(2):255-260. 35夏

23、灿,蒋蔚,刘迎春,等.肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方式方法的建立J.畜牧与兽医,2021,48(10):13-21. 36左乐,姜伊祥,万敏,等.多重荧光PCR技术快速鉴定常见15种沙门菌血清型J.卫生研究,2020,49(5):823-828. 37郑玉玺,韩明,李崇高,等.3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方式方法的建立J.食品安全质量检测学报,2020,11(3):866-874. 38王警,张碧成,郭芸芸,等.多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的4个血清型J.食品安全质量检测学报,2022,10(2):440-446. 39中国家卫生和计划生育

24、委员会. GB 29921 2020食品安全国家标准食品中致病菌限量S.北京:中国标准出版社,2020. 40LUDWIG J B,SHI X,SHRIDHAR P B,et al.Multiplex PCR assays for the detection of one hundred and thirty seven serogroups of shiga toxin-producing Escherichia coli associated with cattleJ. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,2020,10:378

25、. 41刘晓萌,周立,王振虹,等.支气管异物并下呼吸道感染患儿病原菌多重PCR检测结果分析J.精准医学杂志,2020,35(3):250-252. 42白龙,邵毅,黄柳娟,等.鸡源细菌中5种四环素耐药基因多重PCR检测方式方法的建立J.食品与机械,2021,34(10):55-59. 43陈伟,杨迎伍,邓伟,等.3种致病菌多重PCR检测体系的建立及应用J.食品与发酵工业,2008(9):132-136. 44季圣翔.比拟常规PCR与多重PCR在食物中毒致病菌检测中的应用J.职业与健康,2020,28(24):3087-3090. 45钟泽澄,王进,张师音.多重PCR技术研究进展J.生物工程学报,2020,36(2):171-179.