视网膜血管铺片技术的优化创新,中医眼科论文.docx

《视网膜血管铺片技术的优化创新,中医眼科论文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《视网膜血管铺片技术的优化创新,中医眼科论文.docx（8页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、视网膜血管铺片技术的优化创新,中医眼科论文视网膜是由大脑向外延伸的视觉神经末梢组织，其构造复杂、精细、脆弱而代谢旺盛。其血管属于终末血管系统，任何病理性的毁坏和血管梗阻等引起的组织缺氧，均能导致组织坏死，使其丧失感受和传导光刺激的功能。因而血管改变是视网膜病变的重要特点。视网膜血管铺片是研究视网膜血管病变的重要技术。但这项技术的消化时间不宜把握，展片难度大，很难制备出理想的视网膜血管铺片。国内外学者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶 - 胰蛋白酶联合消化制备视网膜血管铺片。在本研究中，我们总结前人经历体验，不断探索改良，建立了新的视网膜血管铺片技术，现总结如下。 1 材料和方式方法 1. 1 材

2、料 BALB / c 小鼠来源于军事医学科学院实验动物中心【SCXK 军 2020 -0004】，SD 大鼠购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究中心【SCXK 京 2020 -0001】，SYXK 京 2020 -0019.犬购自北京日新科技有限公司【SCXK 京 2018 - 0007】，恒河猴由中国医学科学院医学实验动物研究所提供【SCXK 京 2020 - 0011】，SYXK 京 2018 -0030.苏木素及伊红 Y 染色液均为国产试剂 益利精 细 ,高 碘 酸 批 号 011108,北 京 ,Schiff UFG0108,上海 ,Proteinase K CALBIOCHEM

3、,cat # 539480 ,Trypsin 1: 250 Porcine Pancreas AMRESCO,lot #2861C173 ,anti-CD31 antibody ABCAM,ab28364 ,anti-VEGF antibody BOSTER,cat#BA0407 ,兔 超敏二步法免疫组化检测试剂 中杉金桥，PV - 9001 .正常羊血清工作液 中杉金桥，ZLI - 9056 ,抗体稀释液 中杉金桥，ZLI -9030 . 1. 2 方式方法 1. 2. 1 大鼠视网膜血管铺片的制备 大鼠脱颈椎法处死，摘取眼球，固定于 10% 中性福尔马林。 沿距齿缘剪开眼球去除晶状体，用蒸

4、馏水漂洗，以视神经乳头为中心将眼球壁均匀地剪成 4 份，剥离眼球壁视网膜层，再用蒸馏水漂洗。 将剥离出的视网膜放在蒸馏水中 37孵育 1 2 h,蒸馏水漂洗，孵育后的视网膜放入 1 g / L 的蛋白酶 K 中，56消化 13 17min,去除消化掉的感光层细胞，蒸馏水漂洗，再将视网膜层放入 3% 胰蛋白酶消化液中，37消化 40 60 min. 用吸管将半透明状的血管网移入蒸馏水中漂洗，用吸管轻轻吹打非透明状区域，直到血管网成透明状，再将吹打成透明状的血管网铺到含多聚赖氨酸的载玻片上，展平，自然枯燥。 在消化经过中，蛋白酶 k 消化时，每 5 min 轻柔摇动一次，再以最低完成消化时间为观察

5、起点： 蛋白酶 K 消化 13 min 时，肉眼观察，轻柔摇动，若见感光层细胞脱落，即完成第一步消化。若消化不完全，每 2 min 轻柔摇动观察一次，直至感光层脱落。 胰蛋白酶消化时，每 10 min 轻柔摇动一次，也是以最低完成消化时间为观察起点，若消化不完全，每5min 轻柔摇动观察一次。 1. 2. 2 不同动物的视网膜在消化酶中的消化时间 在大鼠铺片基础上，我们探索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴视网膜血管铺片的消化时间表 1. BALB / c 小鼠眼球小，在剥取视网膜层之前，要将眼球壁均匀剪成 2 份。犬和恒河猴眼球较大，构造特殊，取材后需立即固定 4h,再用锋利的刀片在眼球的上

6、下部各切开一个小口，继续固定 24h.将眼球壁均匀地剪成若干等份，每一等份大小约 0. 4 cm 0. 4 cm,再剥离视网膜层。 1. 2. 3 视网膜血管铺片 HE 染色 将视网膜血管铺片置于自来水中水化 15 min,苏木苏染核 1 min,自来水冲洗，伊红复染 2 min,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 1. 2. 4 视网膜血管铺片 PAS 染色 PAS 染色方式方法参照文献1: 将视网膜血管铺片置于自来水中水化 15 min,蒸馏水洗 2 次，参加高碘酸氧化 10 min,蒸馏水速洗 2 次，参加 schiff 试剂反响5 min,自来水流水冲洗2 min,苏木素染核2

7、min,自来水返蓝5 min,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 1. 2. 5 视网膜血管铺片免疫组化染色 免疫组化染色方式方法参照文献2,略有改变： 将视网膜血管铺片置于 PBS 中水化 15 min; 微波中火修复5 min; 3%双氧水封闭15 min; 正常羊血清工作液封闭 20 min; 滴加用抗体稀释液稀释的一抗 CD31 稀释度为 1 50; VEGF 稀释度为1 200 ,室温孵育 1. 5 h; 滴加二抗试剂 1,室温孵育 10 min; 滴加二抗试剂 2,室温孵育 10 min; DAB 显色； 苏木素复染 4 s; 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片2 结果。

8、 2. 1 大鼠视网膜血管铺片 经 HE 及 PAS 染色可见： 铺片完好，清楚明晰显示血管走向。各级血管形态清楚明晰，血管分支清楚完好，无断裂现象。细胞形态清楚明晰，细胞核可清楚明晰显示 彩插 12 图 1 . 酶消化会造成部分抗原的丢失，因而需要对抗原进行修复。修复温度太低造成修复不完全，温度太高又会脱片。经过探索，我们发现，微波中火5min 即可将抗原修复。免疫组化结果显示： CD31和血管内皮生长因子 vascular endothelial growthfactor,VEGF 在正常大鼠铺片均有表示出： CD31 在血管周细胞及内皮细胞均有表示出； VEGF 主要在内皮细胞表示出。

9、2. 2 小鼠、狗、猴视网膜铺片 根据大鼠铺片经历体验，我们探索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴的视网膜血管铺片消化时间。经 HE 及PAS 染色，可见血管网完好，无神经组织残留。各级血管构造清楚，大动物小动脉可显示血管壁的平滑肌。毛细血管网由内皮细胞和周细胞组成，细胞形态清楚明晰，细胞核构造清楚 彩插 12 图 2 . 3 讨论 1960 年 Kuwabara3用胰蛋白酶对视网膜进行消化制备了视网膜血管铺片，为视网膜血管的研究提供了一种新的手段。1963 年 Ashton4改良了Kuwabara 的方式方法，用胃蛋白酶 - 胰蛋白酶联合消化法，成功制备了猫的视网膜血管铺片。此后又经过各国学

10、者的不断努力5 -8,才有了今天的技术基础。 视网膜血管消化铺片技术难度较大： 消化不完全，铺片不能充分显示出血管。消化过度，又会造成血管构造不清楚明晰，甚至断裂，直接影响对实验结果的观察和分析。蛋白酶 K 是一种高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解组织细胞，因而在本研究中，我们选择先用蛋白酶 K 消化掉视网膜感光层细胞。 同时，蛋白酶 K 能穿透细胞膜，毁坏细胞核，于是我们将视网膜层漂洗后再移入到 3% 胰蛋白酶中进一步消化。应用蛋白酶 K - 胰蛋白酶联合消化法，成功制备了不同实验动物的视网膜血管铺片。 视网膜血管铺片制备经过中，应注意下面几点： 眼球的固定： 大、小鼠眼球取材后直接固定于10

11、% 中性福尔马林 24 h 以上。狗和猴眼球组织构造特殊，各部分组织构造的软硬度不同，因而取材后立即固定4 h,再用锋利的刀片在眼球的上下部各切开一个小口，继续固定 24 h.由于固定液易造成视网膜血管的断裂，因而固定时间最好不超过72 h.视网膜的剥离： 视网膜位于眼球壁的内层，组织比拟薄，而且附着在色素层上，剥离经过中很容易破碎。因而去除晶状体后，以视神经乳头为中心，将眼球壁剪开成若干等份，轻轻剥离出视网膜。血管的消化： 消化经过中，随时注意观察。蛋白酶 K消化能力极强，每 5 min 稍微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每 2 min 轻柔摇动一次，待肉眼可见感光层脱落即可终止

12、消化。换成胰蛋白酶消化时，每 10 min 稍微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每 5 min 轻柔摇动一次，待可见半透明血管网即终止消化。铺片： 将消化好的血管网漂洗干净，平铺于含多聚赖氨酸的载玻片上，不要将载玻片上的水吸干净，否则未贴壁的血管网漂移，影响对血管走向的观察。抗原修复：常规微波修复石蜡切片需要高火3 min,中火5 min,再低火 3 min.而视网膜血管铺片只需中火 5 min即可完成抗原修复。 蛋白酶 K-胰蛋白酶联合消化法制备大鼠视网膜血管铺片成功率高，稳定性好，同时也适用于不同实验动物，为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。 以下为参考文献： 1 李彦红，朱

13、华，徐艳峰，等。 过敏性紫癜兔模型的免疫学改变及机制初探J. 中国实验动物学报。 2020,21 6 : 65 -69. 2 朱华，徐艳峰，刘颖，等。 链脲佐菌素诱导糖尿病恒河猴胰岛细胞数量的变化J. 中国比拟医学杂志。 2020,22 12 : 1- 3. 3 Kuwabara T,Cogan DG. Studies of retinal vascular patterns. I.Normal architecture J. Arch Ophthalmol. 1960,64 6 : 904- 911. 4 Ashton N. Studies of the retinal capillaries in relation to diabeticand other retinopathies J. Brit J Ophthal. 1963,47 9 : 521- 538.