7现代生物技术-酶工程与蛋白质工程-教学课件.ppt

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1、第七章第七章 现代生物技术在现代生物技术在蛋白质工程中的应用蛋白质工程中的应用一、蛋白质芯片技术一、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(protein chip)也称蛋白质微阵列也称蛋白质微阵列(protein microarray),(protein microarray),是将大量蛋白质有规则地固是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间地相互作用检测分底物、蛋白质与其他小分子之间地相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。析蛋白质的一种芯片。本质上就是利用蛋白质之间的相

2、互作用对样品本质上就是利用蛋白质之间的相互作用对样品中存在的特定蛋白质分子进行检测，是从蛋白质水中存在的特定蛋白质分子进行检测，是从蛋白质水平去了解和研究各种生命现象。平去了解和研究各种生命现象。1 1、蛋白质芯片的概念、蛋白质芯片的概念 蛋白质芯片是通过将各种蛋白固定于滴定板、滤蛋白质芯片是通过将各种蛋白固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用经过特定标记的蛋日质或其他成分与芯片作用，经漂经过特定标记的蛋日质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋日质互补结合的成分洗去，再洗将未能与芯片上的蛋日质互补结合的成分洗去，再

3、利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋日质各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋日质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋日质功能之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋日质功能的目的。的目的。2 2、蛋白质芯片的原理、蛋白质芯片的原理3 3、蛋白质芯片的制备、蛋白质芯片的制备 固相载体的选择和处理：膜载体；玻片载体固相载体的选择和处理：膜载体；玻片载体 蛋白质靶标的处理：纯度高，并具生物活性蛋白质靶标的处理：纯度高，并具生物活性 蛋白质靶标的固定蛋白质靶标的固定 蛋白质芯片的封闭蛋白质芯片的封闭

4、4、蛋白质芯片的检测、蛋白质芯片的检测标记：荧光染料；酶；融合表达标记：荧光染料；酶；融合表达GFP/RFPGFP/RFP 绿色萤光蛋白最早是由下村修等人在绿色萤光蛋白最早是由下村修等人在19621962年在一种学名年在一种学名Aequorea victoriaAequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质的过程中还需要冷光蛋白质AequorinAequorin的帮助，且这个冷光蛋的帮助，且这个冷光蛋白质与钙

5、离子白质与钙离子(Ca+2)(Ca+2)可产生交互作用。它是一种化学性能稳可产生交互作用。它是一种化学性能稳定的小分子蛋白质定的小分子蛋白质,它能在紫外光激发下发出易于检测的绿它能在紫外光激发下发出易于检测的绿色荧光。色荧光。gfpgfp基因与目的基因相连接基因与目的基因相连接,不影响目的基因表达且不影响目的基因表达且能较好地标识出目的基因位置。现已证实它是一种重要的标能较好地标识出目的基因位置。现已证实它是一种重要的标记基因记基因,在应用基因治疗胶质细胞瘤、探讨肿瘤侵袭机制与在应用基因治疗胶质细胞瘤、探讨肿瘤侵袭机制与模式模式,以及研究肿瘤微血管构建等方面具有重要作用。以及研究肿瘤微血管构建

6、等方面具有重要作用。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白Green fluorescent protein，GFP诺贝尔化学奖解读诺贝尔化学奖解读“绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白”让未知世界显影让未知世界显影当地时间当地时间1010月月8 8日日1111时时4545分，诺贝尔自然科学奖最后一个奖项化学奖在瑞分，诺贝尔自然科学奖最后一个奖项化学奖在瑞典皇家科学院揭晓。典皇家科学院揭晓。3 3位美国科学家位美国科学家 美国伍兹美国伍兹霍尔海洋生物学研究所日霍尔海洋生物学研究所日裔科学家下村修、哥伦比亚大学神经生物学教授马丁裔科学家下村修、哥伦比亚大学神经生物学教授马丁查尔菲、加州大学圣迭查尔菲、加州大学圣迭戈分校华

7、裔生物学家钱永健，因为发现了在生物化学领域极为重要的戈分校华裔生物学家钱永健，因为发现了在生物化学领域极为重要的“绿色荧绿色荧光蛋白光蛋白”而获此殊荣，而获此殊荣，3 3人将平分人将平分10001000万瑞典克朗万瑞典克朗(约约140140万美元万美元)的奖金。日的奖金。日本读卖新闻本读卖新闻1010月月1212日对该奖项进行了解读。日对该奖项进行了解读。科学家接力研究发光生物科学家接力研究发光生物绿色荧光蛋白是一种能在蓝色波长光线激发下发出荧光的特殊蛋白质，正绿色荧光蛋白是一种能在蓝色波长光线激发下发出荧光的特殊蛋白质，正是这种神奇的性质，让它成为当今生物化学领域最有力的工具之一，被称为是这

8、种神奇的性质，让它成为当今生物化学领域最有力的工具之一，被称为“生物北斗生物北斗”。生物化学家们的研究对象常常是细胞、分子、基因等在显微镜下。生物化学家们的研究对象常常是细胞、分子、基因等在显微镜下才会才会“现形现形”的物质。显微镜下的微观世界与我们看到的宏观世界极为不同，的物质。显微镜下的微观世界与我们看到的宏观世界极为不同，而而GFPGFP的作用是在微观与宏观间架起一座桥梁，让科学家通过观察发光效应推的作用是在微观与宏观间架起一座桥梁，让科学家通过观察发光效应推测出分子水平上的活动。这测出分子水平上的活动。这3 3位发现位发现 GFP GFP的科学家最终获奖，也说明了这一成的科学家最终获奖

9、，也说明了这一成果的重要性。果的重要性。生物发光分为两种，一种是由生物体内一种荧光酶作为催化剂参与发光反生物发光分为两种，一种是由生物体内一种荧光酶作为催化剂参与发光反应，另一种是生物体内某种蛋白质本身能发光。前者早在上世纪初就已被研究应，另一种是生物体内某种蛋白质本身能发光。前者早在上世纪初就已被研究得较为全面，而发光蛋白质的系统研究起源于上世纪得较为全面，而发光蛋白质的系统研究起源于上世纪5050年代下村修所做的开创年代下村修所做的开创性工作。性工作。1955 1955年两位美国海洋生物学家达文波特与尼可，首次发现了水母可以年两位美国海洋生物学家达文波特与尼可，首次发现了水母可以发绿光，但

10、他们无法解释原因，这一发现被下村修敏锐地捕捉到了。发绿光，但他们无法解释原因，这一发现被下村修敏锐地捕捉到了。19611961年，当时还在普林斯顿大学工作的下村修与同事们，在当地的星期五港附年，当时还在普林斯顿大学工作的下村修与同事们，在当地的星期五港附近收集了约一万只水母来研究，终于在一种叫做维多利亚水母的体内，分近收集了约一万只水母来研究，终于在一种叫做维多利亚水母的体内，分离纯化了水母中的发光蛋白离纯化了水母中的发光蛋白水母素。他们还发现了另外一种蛋白，它水母素。他们还发现了另外一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下呈强烈绿色。经过研究发现，在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外

11、光下呈强烈绿色。经过研究发现，这是钙离子在与水母素的交互作用中发生了能量交换，从而产生了发光效这是钙离子在与水母素的交互作用中发生了能量交换，从而产生了发光效应应(一种能量释放形式一种能量释放形式)。19621962年下村修与美国科学家弗兰克年下村修与美国科学家弗兰克约翰逊在美国细胞生物学权威期约翰逊在美国细胞生物学权威期刊细胞和比较生理学上发表了相关论文，这是对蛋白质发光进行系统刊细胞和比较生理学上发表了相关论文，这是对蛋白质发光进行系统分析的最早论文。经过十几年的艰苦研究，分析的最早论文。经过十几年的艰苦研究，19741974年他们终于提取出了这种年他们终于提取出了这种蛋白，这就是后来的蛋

12、白，这就是后来的“绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白”。下村修并未意识到下村修并未意识到GFPGFP的重要应用价值，他离开普林斯顿大学到伍兹的重要应用价值，他离开普林斯顿大学到伍兹霍尔海洋生物学研究所后，其同事道格拉斯霍尔海洋生物学研究所后，其同事道格拉斯 普瑞舍对普瑞舍对GFPGFP很感兴趣，很感兴趣，19851985年与年与19921992年，普瑞舍分别提取出了水母素与年，普瑞舍分别提取出了水母素与GFPGFP的的DNADNA，在将其打造成，在将其打造成“生物北斗生物北斗”的过程中迈出了关键一步。的过程中迈出了关键一步。化学反应中有一种被称做化学反应中有一种被称做“同位素标记法同位素标记法”的分析方

13、法，利用化学性的分析方法，利用化学性质稳定、不参与反应过程的同位素质稳定、不参与反应过程的同位素(指一种元素具有相同核电荷但原子质量指一种元素具有相同核电荷但原子质量不同的原子不同的原子)追踪化学反应。但这种方法在分子生物学等领域不太有效，因追踪化学反应。但这种方法在分子生物学等领域不太有效，因为分子生物学需要的不仅是化学反应，它对化学反应在细胞、组织间的具为分子生物学需要的不仅是化学反应，它对化学反应在细胞、组织间的具体传递过程等更感兴趣。体传递过程等更感兴趣。GFPGFP的发光反应正好填补了这一空缺，英国苏格的发光反应正好填补了这一空缺，英国苏格兰人报在一篇报道中将兰人报在一篇报道中将GF

14、PGFP比作比作“分子侦探分子侦探”。钱永健的研究使得成为钱永健的研究使得成为“侦探侦探”的荧光蛋白，不再局限于绿色发光蛋的荧光蛋白，不再局限于绿色发光蛋白，他定向改造出多种不同的荧光蛋白，有的荧光更强，有的呈黄色、蓝白，他定向改造出多种不同的荧光蛋白，有的荧光更强，有的呈黄色、蓝色，有的可激活、变色，俄罗斯生物学家谢尔盖色，有的可激活、变色，俄罗斯生物学家谢尔盖卢克雅罗夫在珊瑚里发卢克雅罗夫在珊瑚里发现了其他荧光蛋白现了其他荧光蛋白(FP)(FP)，包括红色荧光蛋白。荧光蛋白的多样化使其应用，包括红色荧光蛋白。荧光蛋白的多样化使其应用范围更加广泛，如可以同时用多种不同荧光蛋白对细胞进行标记。

15、范围更加广泛，如可以同时用多种不同荧光蛋白对细胞进行标记。荧光蛋白技术使得人们可以研究某些分子的活性。对有些研究来说，荧光蛋白技术使得人们可以研究某些分子的活性。对有些研究来说，荧光蛋白的作用可谓荧光蛋白的作用可谓“起死回生起死回生”。原来有些研究方法，需要把生物变成。原来有些研究方法，需要把生物变成死物才能了解一些现象和过程，而以荧光蛋白为主要支柱之一的现代生物死物才能了解一些现象和过程，而以荧光蛋白为主要支柱之一的现代生物成像技术，使科学家在活的细胞中观察和研究这些过程，能把一部分成像技术，使科学家在活的细胞中观察和研究这些过程，能把一部分“死死物学物学”变成变成“生物学生物学”。神奇的荧

16、光蛋白：让老鼠和猪也发光神奇的荧光蛋白：让老鼠和猪也发光 蛋白芯片能帮助科学家们同时检测数以万蛋白芯片能帮助科学家们同时检测数以万计的不同蛋白，观测这些蛋白在细胞中如何相计的不同蛋白，观测这些蛋白在细胞中如何相互作，如何与互作，如何与DNADNA，以及药物作用的，并且在分，以及药物作用的，并且在分析大量蛋白的同时，各个蛋白之间也不会受到析大量蛋白的同时，各个蛋白之间也不会受到影响。除此之外，即使是微量的蛋白影响。除此之外，即使是微量的蛋白，尤其是尤其是提取的稀少蛋白，这种技术能帮助获得大量的提取的稀少蛋白，这种技术能帮助获得大量的数据。数据。5、蛋白质芯片的特点、蛋白质芯片的特点1 1、SPR

17、SPR的原理的原理 SPRSPR是一种物理光学现象，将一束平面单色偏振光是一种物理光学现象，将一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀有薄层金膜的玻璃表面发生全反以一定角度入射到镀有薄层金膜的玻璃表面发生全反射时射时,若入射光的波向量与金膜内表面电子的振荡频若入射光的波向量与金膜内表面电子的振荡频率匹配率匹配,光线即耦合入金膜引发电子共振光线即耦合入金膜引发电子共振,即表面等离即表面等离子共振。子共振。由于由于SPRSPR对金属表面电介质的折射率非常敏对金属表面电介质的折射率非常敏感感,不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电不同电介质其表面等离子体共振角不同。同种电介质介质,其附在金属表面的量

18、不同其附在金属表面的量不同,则则SPRSPR的响应强度的响应强度不同。不同。SPRSPR对对附附着着在在金金属属薄薄膜膜表表面面的的介介质质折折射射率率非非常常敏敏感感,当当表表面面介介质质的的属属性性改改变变或或者者附附着着量量改改变变时时，共共振振角角将将不不同同。因因此此，SPRSPR谱谱（共共振振角角的的变变化化vsvs时时间间）能能够够反反映映与与金金属属膜膜表表面面接接触触的的体体系系的的变化。变化。BIA BIA是基于是基于SPRSPR技术来实时跟踪生物分子间的相互作技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物的技术。用，而不用任何标记物的技术。SPRSPR是一种物理光学

19、现是一种物理光学现象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜象。在发生全反射的界面涂上一薄层金膜(或其它金属或其它金属膜膜)约约50nm50nm厚，由于金膜中有自由电子，它们并不是静厚，由于金膜中有自由电子，它们并不是静止不动而是不停在平衡位置附近振动，并具有一定的止不动而是不停在平衡位置附近振动，并具有一定的频率。当光由另一侧以大于临界角入射有金膜的界面，频率。当光由另一侧以大于临界角入射有金膜的界面，由于入射光会在界面方向有一分量，当这一分量与金由于入射光会在界面方向有一分量，当这一分量与金膜中电子振荡频率相同时，两种能量会发生整合，使膜中电子振荡频率相同时，两种能量会发生整合，使在某个角度上发

20、射光能量降低，这个能量降低的角度在某个角度上发射光能量降低，这个能量降低的角度成为成为SPRSPR角。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同角。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时时,SPR,SPR角的位置将不同，根据角的位置将不同，根据SPRSPR角的变化可以推断角的变化可以推断所发生的变化。所发生的变化。2 2、SPRSPR仪的结构仪的结构 SPR SPR仪主要包括仪主要包括光波导光波导器件器件、金属薄膜金属薄膜、生物分生物分子膜子膜三个组成部分。其关三个组成部分。其关键在于金属薄膜和生物分键在于金属薄膜和生物分子膜的沉积。金属薄膜通子膜的沉积。金属薄膜通常采用银膜，但是对于光常采用银膜，

21、但是对于光纤型的传感则更多的使用纤型的传感则更多的使用金膜。膜厚度通常为金膜。膜厚度通常为606090nm90nm。生物分子膜的成膜方法包括金属膜直接吸附法、共生物分子膜的成膜方法包括金属膜直接吸附法、共价连接法、单分子复合膜技术。目前又出现了软光价连接法、单分子复合膜技术。目前又出现了软光刻新技术刻新技术(又称为分子印膜技术又称为分子印膜技术)，用于分子水平上，用于分子水平上构造敏感表面。构造敏感表面。在在-的实时监测中的实时监测中,可以获悉可以获悉:(1)(1)特异性特异性：哪些分子发生了相互作用：哪些分子发生了相互作用?(2)(2)浓度浓度：存在多少结合分子：存在多少结合分子?(3)(3

22、)动力学动力学：相互作用的速率、结合和解离的比例：相互作用的速率、结合和解离的比例是多少是多少?(4)(4)亲和性亲和性：相互作用的程度有多大：相互作用的程度有多大?(5)(5)协同作用协同作用：是否存在任何异构效应：是否存在任何异构效应?(6)(6)相互作用模式相互作用模式：结合模式与不同样品是否存在：结合模式与不同样品是否存在对应关系对应关系?优点：优点：待测物无需标记待测物无需标记适用于混浊、不透明或者有色溶液适用于混浊、不透明或者有色溶液能实时、连续监测反应动态过程能实时、连续监测反应动态过程检测方便、快捷检测方便、快捷应用范围广应用范围广不足：不足：难以区分非特异性吸附难以区分非特异

23、性吸附对温度、样品组成等干扰因素敏感对温度、样品组成等干扰因素敏感4 4、SPRSPR的特点的特点 典型的真核生长转录因子典型的真核生长转录因子(GAL4(GAL4、GCN4)GCN4)都含有两个都含有两个不同的结构域不同的结构域:DNADNA结合结构域结合结构域BDBD(DNA-binding(DNA-binding domain)domain)和和转录激活结构域转录激活结构域ADAD(transcriptional(transcriptional activating domain),activating domain),前者可识别前者可识别DNADNA上的特异序列，上的特异序列，并使转录

24、激活结构域定位于所调节的基因的上游，转并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且两结构域区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作蛋白的相互作用。用。1 1、酵母双杂交的原理、酵母双杂交的原理3

25、3、酵母双杂交的应用、酵母双杂交的应用检验一对功能已知蛋白间的相互作用检验一对功能已知蛋白间的相互作用研究一对蛋白间发生相互作用所必须的研究一对蛋白间发生相互作用所必须的结构域结构域用已知功能的蛋白基因筛选双杂交用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNAcDNA文库文库分析新基因的生物学功能分析新基因的生物学功能 酵母双杂交系统的一个重要的问题是酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性假阳性”。由于某些。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使用，使DNADNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下结合结构域杂

26、交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生表达，产生“假阳性假阳性”结果。结果。许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，例如采用假阳许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展，例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少性显示分析法和双筛选系统以减少“假阳性假阳性”的发生；发展哺的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白质的相互作用。其中双筛选乳动物双杂交系统更好地研究蛋白质的相互作用

27、。其中双筛选系统用二种不同的报告基因系统用二种不同的报告基因(常用常用lacZlacZ和和HIS3)HIS3)有以下优势有以下优势:用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，可可明显减少假阳性。明显减少假阳性。通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统也是一种基因水平上以重建转也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在此系统中，一录因子功能为基础的体内分析方法。在

28、此系统中，一种感性趣的蛋白与种感性趣的蛋白与Gal4-DNAGal4-DNA结合结构域构成融合蛋白，结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16VP16蛋白的激活结构域以蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体载体(CAT)(CAT)共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个Gal4Gal4结合位点下游的结合位点下游的catcat基因。假如两个融合蛋白相互基因。假如两个融合蛋白相互作用则作用则catcat报道基因表达水平明显增高。用此系统证实报道基因表

29、达水平明显增高。用此系统证实了了P53P53蛋白与大蛋白与大T T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果，且较酵母双杂交系统更为快速，在系统相同的结果，且较酵母双杂交系统更为快速，在转染转染48h48h内得到结果，并且在哺乳动物细胞能更好模仿内得到结果，并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白体内的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系蛋白相互作用。因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。酵母单杂交技术 1 1、酵母单杂交的基本原理、酵母单杂交的基本原理酵母单杂交技术是酵母单杂交技术是19931993年

30、由酵母双杂交技术发展而来的，年由酵母双杂交技术发展而来的，用于酵母单杂交系统的酵母用于酵母单杂交系统的酵母GAL4GAL4蛋白是一种典型的转录因子，蛋白是一种典型的转录因子，GAL4GAL4的的DNADNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可结结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可结合酵母半乳糖苷酶的上游激活位点合酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)(UAS)，而转录激活结构域，而转录激活结构域可与可与RNARNA聚合酶或转录因子聚合酶或转录因子TFIIDTFIID相互作用，提高相互作用，提高RNARNA聚合酶的聚合酶的活性。在这一过程中，活性。在这一过程中，DNADNA结合结构域

31、和转录激活结构域可完结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此可将全独立地发挥作用。据此可将GAL4GAL4的的DNADNA结合结构域置换为文结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活同样可通过转录激活结构域激活RNARNA聚合酶，启动下游报告基聚合酶，启动下游报告基因的转录。因的转录。2 2、酵母单杂交的基本操作过程、酵母单杂交的基本操作过程(1)(1)设计含目的基因设计含目的基因(称为诱饵称为诱饵)和下游报告基因的质粒，和下游报告基因的质粒，并将其转入酵母细胞。并将其转

32、入酵母细胞。(2)(2)将文库蛋白的编码基因片段与将文库蛋白的编码基因片段与GAL4GAL4转录激活域融合转录激活域融合表达的表达的cDNAcDNA文库质粒转化人同一酵母中。文库质粒转化人同一酵母中。(3)(3)若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的基因就是启动子的基因就是启动子DNADNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。基因结合蛋白。3 3、酵母单杂交技术的应用、酵母单杂交技术的应

33、用 应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNADNA序列结合的蛋白质，同时单杂交技术还被应用于识别金序列结合的蛋白质，同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合，还可用于属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合，还可用于筛选阻碍筛选阻碍DNADNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。在研究在研究DNADNA蛋白质相互作用蛋白质相互作用中，酵母单杂交体系主中，酵母单杂交体系主要有以下用途：要有以下用途：确定已知确定已知DNADNA蛋白质之间是否存在相互蛋白质之间是否存在相互作用

34、；作用；分离结合于目的顺式调控元件或其他短分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNADNA结合位结合位点蛋白的新基因；点蛋白的新基因；定位已经证实的具有相互作用的定位已经证实的具有相互作用的DNADNA结结合蛋白的合蛋白的DNADNA结合结构域，以及准确定位与结合结构域，以及准确定位与DNADNA结合的核苷酸结合的核苷酸序列。序列。三杂交系统的基本原理是将一个已知的三杂交系统的基本原理是将一个已知的RNARNA结结合蛋白与转录因子的合蛋白与转录因子的DNADNA结合结合domain(domain(如如LexA)LexA)构建构建第一个融合蛋白，第二种蛋白第一个融合蛋白，第二种蛋白(待选的待选的R

35、NARNA结合蛋结合蛋白白)与转录激活结构域构建融合蛋白。此外构建和与转录激活结构域构建融合蛋白。此外构建和表达一杂合表达一杂合RNARNA，含有二个不同的结合位点。当，含有二个不同的结合位点。当RNARNA与二个与二个RNARNA结合蛋白的结合位点相互作用时可结合蛋白的结合位点相互作用时可激活报道基因的转录和表达。激活报道基因的转录和表达。酵母三杂交技术 三杂交系统提供了快速、多用的体内检测三杂交系统提供了快速、多用的体内检测RNA-RNA-蛋白间蛋白间相互作用的新方法。相互作用的新方法。1 1应用此系统可分析确定应用此系统可分析确定RNA-RNA-蛋白作用的精确结构域，甚蛋白作用的精确结构

36、域，甚至单个核苷酸或氨基酸残基。至单个核苷酸或氨基酸残基。2 2用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能用于鉴定和克隆识别结合有重要生理功能RNA(RNA(如转录和如转录和定位、定位、RNARNA病毒包装、感染等病毒包装、感染等)的蛋白质，可用于调控的机理的蛋白质，可用于调控的机理研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。研究、疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。3 3通过构建杂交通过构建杂交RNARNA库，可筛选与特定蛋白结合的库，可筛选与特定蛋白结合的RNARNA。4 4有可能在此基础上发展四杂交系统研究有可能在此基础上发展四杂交系统研究RNA-RNARNA-RNA间的相间的相互作用。互作用。

37、大肠杆菌双杂交技术 大肠杆菌双杂交系统是继酵母双杂交系统和哺乳动大肠杆菌双杂交系统是继酵母双杂交系统和哺乳动物细胞双杂交系统之后，产生的另一种直接于细胞内物细胞双杂交系统之后，产生的另一种直接于细胞内检测蛋白与蛋白相互作用的遗传学新方法。与酵母双检测蛋白与蛋白相互作用的遗传学新方法。与酵母双杂交的原理相似，通过将所要研究的蛋白质分别与杂交的原理相似，通过将所要研究的蛋白质分别与DNA DNA 结合域（结合域（DBDDBD）与活化域（）与活化域（ADAD）融合，利用相互）融合，利用相互作用蛋白质提供的桥联功能，使活化域与作用蛋白质提供的桥联功能，使活化域与DNA DNA 结合域结合域结合，从而调

38、控报告基因的表达。报告基因表达的调结合，从而调控报告基因的表达。报告基因表达的调控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。大肠杆菌双杂交系统是根据百日咳博代杆菌大肠杆菌双杂交系统是根据百日咳博代杆菌（Bordetella pertussisBordetella pertussis）中的腺苷酸环化酶）中的腺苷酸环化酶（CyaACyaA）催化的反应为基础建立的。该腺苷酸环）催化的反应为基础建立的。该腺苷酸环化酶催化化酶催化cAMPcAMP的合成反应，其催化结构域可以分的合成反应，其催化结构域可以分成成T18T18和和T25T25两个相对独立的功能单位。将所要研两个

39、相对独立的功能单位。将所要研究的蛋白质分别与究的蛋白质分别与T18T18和和T25T25片断融合后，再导入片断融合后，再导入大肠杆菌大肠杆菌DHP1(cya-)DHP1(cya-)菌株中，如果待检蛋白质间菌株中，如果待检蛋白质间能够相互作用，那么能够相互作用，那么T18T18和和T25T25片断就可借此结合片断就可借此结合到一起，催化形成到一起，催化形成cAMPcAMP。合成的。合成的cAMPcAMP作为一个信作为一个信号分子，可激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操号分子，可激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操纵子的表达，产生可以识别的表型变化。纵子的表达，产生可以识别的表型变化。研究周期短，操作简单

40、。传统的酵母双杂交系统研究周期短，操作简单。传统的酵母双杂交系统需要六天或更久才可得到结果，而大肠杆菌双杂需要六天或更久才可得到结果，而大肠杆菌双杂交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆菌双杂交系统时，分离和扩增质粒都非常简单。菌双杂交系统时，分离和扩增质粒都非常简单。能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，酵母细胞的转化效率只能达到酵母细胞的转化效率只能达到106cfu/gDNA106cfu/gDNA，而大肠杆菌细胞可达到而大肠杆菌细胞可达到109cfu/gDNA109cfu/gDNA。大肠杆菌双杂交技

41、术的特点和优点：大肠杆菌双杂交技术的特点和优点：更低的假阳性率和假阴性率。大肠杆菌的遗传体更低的假阳性率和假阴性率。大肠杆菌的遗传体系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相比，系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相比，又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋白所引起核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋白所引起的假阳性和假阴性现象。此外，一些真核的调控的假阳性和假阴性现象。此外，一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，而同样的情况蛋白有可能对酵母细胞产生毒害，而同样的情况发生在大肠杆菌中的可能性会小得多。而且，采发

42、生在大肠杆菌中的可能性会小得多。而且，采用大肠杆菌作为筛选宿主，还能够避免传统酵母用大肠杆菌作为筛选宿主，还能够避免传统酵母双杂交系统对于核定位的要求。双杂交系统对于核定位的要求。四、其他相关技术四、其他相关技术 与与SouthernSouthern或或NorthernNorthern杂交方法类似，但杂交方法类似，但Western Western BlotBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标记的二抗。经过用标记的二抗。经过PAGEPAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体分离的蛋白质样品，

43、转移到固相载体(如硝酸纤维如硝酸纤维素薄膜素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水

44、平的表达。蛋白水平的表达。蛋白质免疫印迹实验蛋白质免疫印迹实验Western Blotting蛋白质相互作用实验方法蛋白质相互作用实验方法-Far Western-Far Western Western blot Western blot是免疫印记，而是免疫印记，而Far westernFar western是蛋白质铺盖技术，是蛋白质铺盖技术，两者其实在本质上是相似的，只是免疫印记是直接用抗体去检两者其实在本质上是相似的，只是免疫印记是直接用抗体去检测抗原，常用于蛋白质定性；而测抗原，常用于蛋白质定性；而Far westernFar western则是用标记的蛋白则是用标记的蛋白(125I(1

45、25I或荧光或荧光)去去probeprobe与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。实验步骤：实验步骤：1.1.表达和提纯获得蛋白表达和提纯获得蛋白A A，并作荧光或放射性标记，或制备抗，并作荧光或放射性标记，或制备抗A A抗体抗体2.2.细胞总蛋白细胞总蛋白SDS-PAGE(?)SDS-PAGE(?)3.3.电转膜电转膜4.4.封闭封闭5.5.加入蛋白加入蛋白A A，如，如A A带标记，洗膜后直接显影；如未标记，可加带标记，洗膜后直接显影；如未标记，

46、可加抗抗A A抗体再加二抗或标记的蛋白抗体再加二抗或标记的蛋白A A。优点：简单、经济优点：简单、经济缺点：缺点：SDS-PAGESDS-PAGE影响蛋白质构象，可能影响相互作用影响蛋白质构象，可能影响相互作用凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验 electrophoretic mobility shift assay,EMSA 基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。后。EMSA EMSA是一种检测蛋白质和是一

47、种检测蛋白质和DNADNA序列相互结序列相互结合的技术，也用于研究合的技术，也用于研究RNARNA结合蛋白和特定的结合蛋白和特定的RNARNA序列的相互作用，成为转录因子研究的经序列的相互作用，成为转录因子研究的经典方法。典方法。免疫共沉淀免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation,CO-IP 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非

48、变性条件下被裂解其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X X的的抗体免疫沉淀抗体免疫沉淀X X，那么与，那么与X X在体内结合的蛋白在体内结合的蛋白质质Y Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。一种特定蛋白质的新的作用搭档。Summary of a traditional immunoprecipitatio

49、n procedure.Summary of a traditional co-immunoprecipitation GST pull-downGST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术交系统的体外试验技术,其基本原理是将靶蛋白其基本原理是将靶蛋白-GST-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目作为与目的蛋白亲和的支撑物的蛋白亲和的支撑物,充当一种充当一种“诱饵蛋白诱饵蛋白”,”,目的蛋目的蛋白溶液过柱白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白捕获

50、蛋白”(”(目的蛋白目的蛋白),),洗脱结合物后通过洗脱结合物后通过SDS-PAGESDS-PAGE电泳分析电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白白,“,“诱饵蛋白诱饵蛋白”和和“捕获蛋白捕获蛋白”均可通过细胞裂解均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行方法获得。此方法简单易行,操作方便。操作方便。GSTGST：谷胱甘肽巯基转移酶：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase(glutathione S-tran