实验部分-病原生物与免疫学基础中职课件.ppt

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1、病原生物与免疫学基础病原生物与免疫学基础实验指导实验指导一、实验目的一、实验目的病原生物与免疫学基础实验是本课程重要组病原生物与免疫学基础实验是本课程重要组成部分，是理论与实验研究的技术基础。通成部分，是理论与实验研究的技术基础。通过实验，加深学生对基本理论知识的理解；过实验，加深学生对基本理论知识的理解；通过实验操作，掌握有关的基本操作技能和通过实验操作，掌握有关的基本操作技能和无菌技术，建立无菌观念；通过正确地观察无菌技术，建立无菌观念；通过正确地观察和分析实验结果，培养学生实事求是的科学和分析实验结果，培养学生实事求是的科学态度、严肃认真的工作作风及分析和解决问态度、严肃认真的工作作风及

2、分析和解决问题的能力。题的能力。二、实验要求二、实验要求1.在每次实验前必须复习相关理论知识，预在每次实验前必须复习相关理论知识，预习实验内容，对实验的目的、要求、方法和习实验内容，对实验的目的、要求、方法和步骤做到心中有数。步骤做到心中有数。2实验过程中，加强无菌观念，严格无菌实验过程中，加强无菌观念，严格无菌操作，操作时必须戴口罩，不要开风扇。操作，操作时必须戴口罩，不要开风扇。3实验过程中，坚持实事求是，认真分析，实验过程中，坚持实事求是，认真分析，真实记录实验结果，如实验结果与理论不符，真实记录实验结果，如实验结果与理论不符，应查找原因。应查找原因。4对实验过程与结果应认真观察并记录之

3、，对实验过程与结果应认真观察并记录之，及时写出实验报告。及时写出实验报告。三、实验室规则三、实验室规则本门课程的实验操作对象多为病原生物，具有一定的传染本门课程的实验操作对象多为病原生物，具有一定的传染性。因此，必须严格遵守实验室规则，按要求进行操作，性。因此，必须严格遵守实验室规则，按要求进行操作，防止发生实验室感染。防止发生实验室感染。1.进入实验室应穿白大衣，离开实验室前脱下并反折放好，进入实验室应穿白大衣，离开实验室前脱下并反折放好，要经常清洗，保持洁净。要经常清洗，保持洁净。2.非实验必要的物品如书包等，不得带入实验室。带进实验非实验必要的物品如书包等，不得带入实验室。带进实验室的教

4、材和文具，要远离操室的教材和文具，要远离操作部位，以免污染。作部位，以免污染。3禁止在实验室内饮食、吸烟或用嘴湿润标签、铅笔等。禁止在实验室内饮食、吸烟或用嘴湿润标签、铅笔等。4实验时不得高声谈笑和来回走动，以保证实验室的安静、实验时不得高声谈笑和来回走动，以保证实验室的安静、有序，利于集中精力完成实验操作。有序，利于集中精力完成实验操作。5.实验中需要进行培养的微生物，应做好标记及处理方法。实验中需要进行培养的微生物，应做好标记及处理方法。实验一实验一 细菌形态检查细菌形态检查【实验目的】【实验目的】.学会：显微镜油镜的使用和保护方学会：显微镜油镜的使用和保护方法法.掌握：显微镜采光的方法要

5、点掌握：显微镜采光的方法要点.能够辨认：细菌的基本形态和特殊能够辨认：细菌的基本形态和特殊结构结构.学会：制备细菌涂片及革兰染色方学会：制备细菌涂片及革兰染色方法和结果判断法和结果判断【实验内容及方法】【实验内容及方法】一、显微镜油镜的使用和保护方法一、显微镜油镜的使用和保护方法(操作操作)（一）油镜原理（一）油镜原理（二）油镜使用方法（二）油镜使用方法（三）显微镜的保护（三）显微镜的保护（一）油镜原理（一）油镜原理细菌个体微小，必须借助显微镜油镜放细菌个体微小，必须借助显微镜油镜放大大1000倍才能看到。因玻璃和香柏油倍才能看到。因玻璃和香柏油折光率相近似折光率相近似(约为约为1.52)，所

6、以在玻片，所以在玻片上加一滴香柏油，把玻片与油镜头连接，上加一滴香柏油，把玻片与油镜头连接，使由聚光器照射上来的光线通过玻片和使由聚光器照射上来的光线通过玻片和香柏油时，不发生折射而直接进入透镜香柏油时，不发生折射而直接进入透镜的光量增多，视野亮度增强，因而获得的光量增多，视野亮度增强，因而获得清晰的物象清晰的物象(实验图实验图1-1)。（二）油镜使用方法（二）油镜使用方法1放置显微镜放置显微镜 2对光对光 聚光器上升到与载物台持平。聚光器上升到与载物台持平。以自然光为光源时，宜用平面镜对准光源；采用人工灯光为光源时，用凹面镜以自然光为光源时，宜用平面镜对准光源；采用人工灯光为光源时，用凹面镜

7、对准光源。对准光源。光圈完全打开。光圈完全打开。3转换油镜头转换油镜头 油镜头的三个标志：油镜头的三个标志：油镜头上标有油镜头上标有100；镜头前端有白色圆圈；镜头前端有白色圆圈；刻有刻有“油油”或或“Oil”字样。字样。4调节焦距调节焦距 5观察方法观察方法6擦镜擦镜 7显微镜还原显微镜还原 （三）显微镜的保护（三）显微镜的保护1显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心爱护，不得随意拆御和碰撞。爱护，不得随意拆御和碰撞。.取送显微镜时应轻拿轻放，一手握镜臂，取送显微镜时应轻拿轻放，一手握镜臂，一手托镜座，防止因震动使镜头受损。一手托镜座，防止因震动使镜头受损。显微

8、镜的调节器只能做有限的旋转，当显微镜的调节器只能做有限的旋转，当旋转感到有阻力时应立即向反方向旋转退回，旋转感到有阻力时应立即向反方向旋转退回，以免碰撞损坏镜头。细调节器用于焦距的细以免碰撞损坏镜头。细调节器用于焦距的细微调节，使用时转动不宜超过微调节，使用时转动不宜超过360o，如需，如需要较大幅度调节时，应使用粗调节器。要较大幅度调节时，应使用粗调节器。.使用显微镜要轻拿轻放，平时放置要注意使用显微镜要轻拿轻放，平时放置要注意通风干燥，防尘防霉防晒。通风干燥，防尘防霉防晒。（一）细菌的基本形态观察（一）细菌的基本形态观察使用显微镜油镜，观察各种球菌、杆菌和螺形菌的革兰染使用显微镜油镜，观察

9、各种球菌、杆菌和螺形菌的革兰染色标本片，以认识细菌的基本形态。观察时应注意细菌的色标本片，以认识细菌的基本形态。观察时应注意细菌的形状、大小、排列方式、染色性，同时绘图记录。形状、大小、排列方式、染色性，同时绘图记录。1球菌球菌 葡萄球菌：菌体正圆形，呈葡萄串状排列，葡萄球菌：菌体正圆形，呈葡萄串状排列，染成紫蓝色，为革兰染色阳性球菌；染成紫蓝色，为革兰染色阳性球菌；链球菌：菌体正圆链球菌：菌体正圆形，呈链状排列，染成紫蓝色，革兰染色阳性球菌；形，呈链状排列，染成紫蓝色，革兰染色阳性球菌；脑脑膜炎奈瑟菌：菌体肾形，成双排列，染成红色，为革兰染膜炎奈瑟菌：菌体肾形，成双排列，染成红色，为革兰染色

10、阴性球菌。色阴性球菌。2.杆菌杆菌 大肠埃希菌，菌体短杆状，呈分散排列，染成红大肠埃希菌，菌体短杆状，呈分散排列，染成红色，为革兰染色阴性杆菌。色，为革兰染色阴性杆菌。.螺形菌螺形菌 霍乱弧菌，菌体呈弧形，呈分散排列，染成红色，霍乱弧菌，菌体呈弧形，呈分散排列，染成红色，为革兰染色阴性弧菌。为革兰染色阴性弧菌。三细菌涂片标本制作和革兰染色法三细菌涂片标本制作和革兰染色法(操作操作)（一）革兰染色法原理（一）革兰染色法原理（二）实验材料（二）实验材料（三）实验方法（三）实验方法（一）革兰染色法原理（一）革兰染色法原理由于细菌的等电点低（在由于细菌的等电点低（在PH25之间）之间）且带负电荷以及细

11、胞壁结构的差异等原且带负电荷以及细胞壁结构的差异等原因，革兰染色阳性菌可牢固结合带正电因，革兰染色阳性菌可牢固结合带正电荷的碱性结晶紫，不易被酒精脱色，故荷的碱性结晶紫，不易被酒精脱色，故仍保持初染的紫蓝色；革兰染色阴性菌仍保持初染的紫蓝色；革兰染色阴性菌等电点较革兰阳性菌等电点高，结合结等电点较革兰阳性菌等电点高，结合结晶紫不牢固，易被酒精脱色故复染呈晶紫不牢固，易被酒精脱色故复染呈红色。红色。（三）实验方法（三）实验方法1制片细菌涂片标本制作的基本步骤为：制片细菌涂片标本制作的基本步骤为：涂片：涂片：取生理盐水各一滴，滴于玻片两侧，以无菌操作取生理盐水各一滴，滴于玻片两侧，以无菌操作的方法

12、，用无菌接种环挑起培养基上葡萄球菌培养物少许，的方法，用无菌接种环挑起培养基上葡萄球菌培养物少许，在玻片一侧的盐水中磨匀，涂布成约在玻片一侧的盐水中磨匀，涂布成约1cm1cm 大小的圆大小的圆形薄膜；再用无菌接种环挑起培养基上大肠杆菌培养物少形薄膜；再用无菌接种环挑起培养基上大肠杆菌培养物少许，在玻片另一侧的盐水中磨匀，也涂布成约许，在玻片另一侧的盐水中磨匀，也涂布成约1cm1cm 大小的圆形薄膜。大小的圆形薄膜。干燥：干燥：把涂好的玻片置于室温中自然干燥，或将菌膜面把涂好的玻片置于室温中自然干燥，或将菌膜面朝上置于酒精灯火焰上方不烤手的高处微微烘干。朝上置于酒精灯火焰上方不烤手的高处微微烘干

13、。固定：固定：将已干燥的涂片膜面向上，玻片与酒精灯火焰接将已干燥的涂片膜面向上，玻片与酒精灯火焰接触，在火焰外焰上水平地快速来回通过火焰触，在火焰外焰上水平地快速来回通过火焰3次，予以固定，次，予以固定，注意不可将菌体烤焦。把固定好的玻片置于染色槽上冷却，注意不可将菌体烤焦。把固定好的玻片置于染色槽上冷却，待冷却后进行染色。待冷却后进行染色。2染色染色 （1）初染：）初染：滴加结晶紫染液于涂膜上，染色滴加结晶紫染液于涂膜上，染色1min后，后，用水轻轻冲洗。用水轻轻冲洗。（2）媒染：）媒染：滴加碘液，约滴加碘液，约1min后，水洗。后，水洗。（3）脱色：）脱色：滴加滴加95乙醇溶液脱色，轻轻摇

14、动玻片乙醇溶液脱色，轻轻摇动玻片至无紫色脱出为止，至无紫色脱出为止，0.5lmin后后(视涂片的厚薄程度视涂片的厚薄程度而定而定)，水洗。，水洗。（4）复染：）复染：滴加释稀复红，染色滴加释稀复红，染色0.51min后，水洗。后，水洗。3镜检镜检 将标本片用吸水纸吸干，加一滴香柏油后用将标本片用吸水纸吸干，加一滴香柏油后用显微镜油镜观察。显微镜油镜观察。4结果结果 葡萄球菌染成紫蓝色，为革兰阳性菌；大肠葡萄球菌染成紫蓝色，为革兰阳性菌；大肠杆菌染成红色，为革兰阴性菌。杆菌染成红色，为革兰阴性菌。【实验作业】【实验作业】(1)列出显微镜油镜头的三个标志。列出显微镜油镜头的三个标志。(2)写出油镜

15、使用时采光的方法要点。写出油镜使用时采光的方法要点。(3)绘出镜下所见的细菌基本形态和特殊结构图。绘出镜下所见的细菌基本形态和特殊结构图。(4)记录革兰染色的结果，并进行分析。记录革兰染色的结果，并进行分析。实验二实验二 细菌的培养与代谢产物观察（示教）细菌的培养与代谢产物观察（示教）【实验目的】【实验目的】1.掌握固体培养基、半固体培养基、液体培掌握固体培养基、半固体培养基、液体培养基的用途。养基的用途。2.熟悉细菌在固体培养基、半固体培养基、熟悉细菌在固体培养基、半固体培养基、液体培养基的生长现象。液体培养基的生长现象。3.了解细菌的接种技术及无菌操作技术概念了解细菌的接种技术及无菌操作技

16、术概念4.了解基础培养基制作的过程了解基础培养基制作的过程【实验内容及方法】【实验内容及方法】一、基础培养基的制作一、基础培养基的制作二、细菌接种法与培养二、细菌接种法与培养三、观察细菌在培养基中的生长现象三、观察细菌在培养基中的生长现象四、细菌代谢产物的观察四、细菌代谢产物的观察（一）肉膏汤培养基（一）肉膏汤培养基1.成分：成分：牛肉膏牛肉膏 0.3g 蛋白胨蛋白胨 1g 氯化钠氯化钠 0.5g 蒸馏水蒸馏水 100ml2.制法：制法：（1）用天平分别称取牛肉膏）用天平分别称取牛肉膏0.3 g，蛋白胨，蛋白胨1g，氯化钠，氯化钠0.5 g置三角烧置三角烧瓶中。瓶中。（2）加入蒸馏水）加入蒸馏

17、水100毫升，把三角烧瓶用酒精灯或电炉加热，使蛋白毫升，把三角烧瓶用酒精灯或电炉加热，使蛋白胨等溶解。胨等溶解。（3）测定培养基的酸碱度。调整至）测定培养基的酸碱度。调整至pH 7.6(可用可用pH试纸测定试纸测定)。必要时。必要时用滤纸过滤。用滤纸过滤。（4）分装试管或烧瓶，塞上棉塞，用玻璃纸包扎管口、瓶口。）分装试管或烧瓶，塞上棉塞，用玻璃纸包扎管口、瓶口。（5）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌103.42kPa 20 min取出冷却后冰箱贮存备用。取出冷却后冰箱贮存备用。3.用途：用途：肉膏汤培养基主要用于增菌。肉膏汤培养基主要用于增菌。（二）固体培养基（二）固体培养基1.成分：成分：肉膏汤培

18、养基肉膏汤培养基 100 ml琼脂琼脂 2g3g2.制法：制法：（1）在上述制备的肉汤中加入琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物）在上述制备的肉汤中加入琼脂。琼脂为海藻中提取的一种多糖类物质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到质，本身无营养作用，不能被细菌利用。因其加热到85后可溶化，冷却后可溶化，冷却至至40左右又可凝固，故可作为固形剂。加热使所有的琼脂全部溶化，以左右又可凝固，故可作为固形剂。加热使所有的琼脂全部溶化，以纱布和脱脂棉过滤，补足蒸发的水，分装三角烧瓶和试管。纱布和脱脂棉过滤，补足蒸发的水，分装三角烧瓶和试管。（2）置高压灭菌器内）置高压灭菌器内103.4kPa（1.0

19、5kg/cm2）蒸气压力下，灭菌）蒸气压力下，灭菌20min，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基，取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，待琼脂凝固即成琼脂斜面培养基（实验图（实验图2-1）。三角烧瓶内培养基冷至）。三角烧瓶内培养基冷至5060时在超净台或无菌室时在超净台或无菌室内将其倾注于灭菌平皿内（内将其倾注于灭菌平皿内（15ml20ml），凝固后即成琼脂平板，放置），凝固后即成琼脂平板，放置冰箱中备用。冰箱中备用。3.用途：用途：普通琼脂培养基主要用于细菌的分离、鉴定、计数、保存菌种。普通琼脂培养基主要用于细菌的分离、鉴定、计数、保存菌种。（三）半固体培养基（三）半

20、固体培养基1.成分：成分：肉膏汤培养基肉膏汤培养基 100 ml 琼脂琼脂 0.51 g2.制法：制法：（1）将）将0.5g1 g琼脂加到琼脂加到100 ml肉膏汤中，肉膏汤中，加热溶化，调整至加热溶化，调整至PH 7.6。（2）分装试管，每管约）分装试管，每管约2 ml3ml，灭菌，灭菌后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。后使试管直立，冷凝后即成半固体培养基。3.用途：用途：半固体培养基用于保存菌种或观察细半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。菌的动力。（一）平板分区划线接种法（一）平板分区划线接种法该法多用于获得细菌的纯种。该法多用于获得细菌的纯种。1.标记标记 在培养皿底玻璃上，用

21、记号笔注明接种的菌名、在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期等。接种者姓名、班级、日期等。2.灭菌接种环灭菌接种环 点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置酒精灯的火焰中烧灼至通红灭菌，如实验图并放置酒精灯的火焰中烧灼至通红灭菌，如实验图2-2，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此方

22、向通过火焰，如此23次。然后将接种环移开火焰，次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距火焰在距火焰10cm范围之内（视此范围为无菌环境）；灭范围之内（视此范围为无菌环境）；灭菌后的接种环不能再碰其它物体。菌后的接种环不能再碰其它物体。实验图实验图2-2 2-2 接种环的灭菌操作接种环的灭菌操作4.分区划线接种细菌分区划线接种细菌（实验图（实验图2-3）实验图实验图2-32-3分区划线接种细菌分区划线接种细菌（1）左手持平板培养基，在火焰上方打开平皿盖，）左手持平板培养基，在火焰上方打开平皿盖，打开角度不能超过打开

23、角度不能超过45，将挑取菌种的接种环在平板，将挑取菌种的接种环在平板培养基的边缘部分涂抹，接种环烧灼、冷却，自涂抹培养基的边缘部分涂抹，接种环烧灼、冷却，自涂抹部分开始，做不重叠来回连续划线，第一区划线面积部分开始，做不重叠来回连续划线，第一区划线面积约占平板的约占平板的1/4。（2）再次烧灼灭菌接种环，冷却，将培养基转动）再次烧灼灭菌接种环，冷却，将培养基转动80左右，进行第二区划线，第二区划线与第一区划线有左右，进行第二区划线，第二区划线与第一区划线有23条相交。烧灼接种环后用相同的方法进行第三区、条相交。烧灼接种环后用相同的方法进行第三区、第四区划线。第四区划线。（3）接种环烧灼灭菌，接

24、种完毕。在平板底部作上）接种环烧灼灭菌，接种完毕。在平板底部作上记号，放入记号，放入37温箱中培育温箱中培育24h后观察结果。注意观后观察结果。注意观察最后察最后12区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、边缘、表面、颜色、透落特征（如菌落大小、形状、边缘、表面、颜色、透明度等情况）。明度等情况）。（二）斜面培养基接种法（二）斜面培养基接种法斜面培养基多用于纯种增菌。斜面培养基多用于纯种增菌。1.在待接种的琼脂斜面培养基试管壁上贴上标在待接种的琼脂斜面培养基试管壁上贴上标签纸，作好标记。签纸，作好标记。2.以无菌操作，用灭菌的接种环从发

25、给的菌种以无菌操作，用灭菌的接种环从发给的菌种上取菌少许（如为琼脂平板培养物应取单个菌上取菌少许（如为琼脂平板培养物应取单个菌落）。落）。3.按无菌操作手续，将所取细菌自琼脂斜面的按无菌操作手续，将所取细菌自琼脂斜面的底部向上轻轻作曲线划线接种。置底部向上轻轻作曲线划线接种。置37温箱培温箱培养养1824h。4.观察结果并记录。观察结果并记录。（三）液体培养基接种法（三）液体培养基接种法1.在待接种肉汤管上写明标记或贴上标签。在待接种肉汤管上写明标记或贴上标签。2.左手握持菌种管及待接种的肉汤管，菌种管在外左手握持菌种管及待接种的肉汤管，菌种管在外侧。侧。3.倾斜肉汤管，接种环灭菌冷却后，伸入

26、菌种管倾斜肉汤管，接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨，使菌混于肉汤中。塞好试管硅胶塞后，轻轻研磨，使菌混于肉汤中。塞好试管硅胶塞后，轻轻摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。轻摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。4.接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉汤接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉汤管放管放37温箱培养，温箱培养，1824h后观察生长情况（观后观察生长情况（观察液体有无混浊、沉淀、颗粒状、菌膜、色泽等）。察液体有无混浊、沉淀、颗粒状、菌膜、色泽等）。（四）半固体培养基接种法（四）半固体培养基接种法

27、半固体培养基用于观察细菌有无动力或保存菌种。有动力的细菌半固体培养基用于观察细菌有无动力或保存菌种。有动力的细菌除在穿刺线上生长外，还可以向四周弥散生长，使整个培养基变除在穿刺线上生长外，还可以向四周弥散生长，使整个培养基变混浊或呈羽绒状；而无动力的细菌只沿着穿刺线生长，穿刺线以混浊或呈羽绒状；而无动力的细菌只沿着穿刺线生长，穿刺线以外的培养基仍澄清。外的培养基仍澄清。此试验分此试验分2组，一组用葡萄球菌或痢疾杆菌，另一组用枯草杆菌组，一组用葡萄球菌或痢疾杆菌，另一组用枯草杆菌或大肠杆菌。或大肠杆菌。1.在待接种的半固体培养基试管上贴好标签。在待接种的半固体培养基试管上贴好标签。2.与液体培养

28、基接种法相同，左手握持菌种管及待接种的半固体与液体培养基接种法相同，左手握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。琼脂培养基。3.右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，从半固体培养基右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，从半固体培养基的中心垂直刺入，达底部（但不能与管底接触，距离管底约的中心垂直刺入，达底部（但不能与管底接触，距离管底约4mm），然后沿原穿刺线路退出（实验图），然后沿原穿刺线路退出（实验图2-4）。）。4.接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架上，塞好硅胶塞，接种完毕，接种针重新灭菌后放至试管架上，塞好硅胶塞，37培养培养1824h小时后取出观察细菌的生长情况并记录。小时后取出观

29、察细菌的生长情况并记录。实验图实验图2-42-4斜面、液体、半固体培养基接种法斜面、液体、半固体培养基接种法 三、观察细菌在培养基中的生长现象三、观察细菌在培养基中的生长现象（一）固体培养基上的生长现象（一）固体培养基上的生长现象（二）液体培养基中的生长现象（二）液体培养基中的生长现象（三）半固体培养基中的生长现象（三）半固体培养基中的生长现象（一）固体培养基上的生长现象（一）固体培养基上的生长现象标本或培养物划线接种到固体培养基表面后，标本或培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为细菌集团，称为菌落菌落。多个

30、菌落密集生长融。多个菌落密集生长融合连成一片叫合连成一片叫菌苔菌苔。注意观察菌落的大小、。注意观察菌落的大小、形态、透明度、颜色、湿润度、表面是否光形态、透明度、颜色、湿润度、表面是否光滑或凸起或凹陷，边缘是否整齐及菌落周围滑或凸起或凹陷，边缘是否整齐及菌落周围有无溶血环等。有无溶血环等。（二）液体培养基中的生长现象（二）液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中有三种生长现象：细菌在液体培养基中有三种生长现象：均匀混浊均匀混浊（葡萄球菌）（葡萄球菌）沉淀生长沉淀生长（链球菌）（链球菌）形成菌膜形成菌膜（枯草芽胞杆菌）（枯草芽胞杆菌）（三）半固体培养基中的生长现象（三）半固体培养基中的生长现象有

31、鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线周围可见线周围可见羽毛状或云雾状混浊羽毛状或云雾状混浊生长（枯草生长（枯草杆菌或大肠杆菌），杆菌或大肠杆菌），动力阳性动力阳性。无鞭毛的细。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线周围的培养基仍然周围的培养基仍然澄清透明澄清透明（痢疾杆菌或葡（痢疾杆菌或葡萄球菌），萄球菌），动力阴性动力阴性。细菌在固体、液体和半固体培养基中的生长细菌在固体、液体和半固体培养基中的生长现象（实验图现象（实验图2-5）。）。实验图实验图2-5细菌在固体、液体和半固体培养基中的生长现象细菌在固体

32、、液体和半固体培养基中的生长现象四、细菌代谢产物的观察四、细菌代谢产物的观察（一）细菌对糖类发酵作用（一）细菌对糖类发酵作用糖发酵试验糖发酵试验（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用（三）尿素分解试验（三）尿素分解试验（四）色素的产生（四）色素的产生（一）细菌对糖类发酵作用（一）细菌对糖类发酵作用糖发酵试验糖发酵试验取葡萄糖取葡萄糖,乳糖发酵管各二支（注意管内的小倒管应充乳糖发酵管各二支（注意管内的小倒管应充满液体，不含气泡），各管分别接种大肠杆菌、伤寒满液体，不含气泡），各管分别接种大肠杆菌、伤寒杆菌，种毕，置杆菌，种毕，置37培养培养1824h，取出看结果

33、，并，取出看结果，并以下列符号作记录：以下列符号作记录：表示分解糖、产酸产气。培养基指示剂（溴甲酚：表示分解糖、产酸产气。培养基指示剂（溴甲酚紫）由紫色变黄色，小倒管内有气泡。紫）由紫色变黄色，小倒管内有气泡。+：表示分解糖，产酸不产气。：表示分解糖，产酸不产气。：表示不分解糖，不产酸不产气。：表示不分解糖，不产酸不产气。（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用（二）细菌对蛋白质或氨基酸的分解作用1.吲哚试验：吲哚试验：取蛋白胨水培养基二支，分别接种大取蛋白胨水培养基二支，分别接种大肠杆菌与伤寒杆菌，种毕，置肠杆菌与伤寒杆菌，种毕，置37培养培养1824h，取出检查。沿管壁徐徐加入约取出检查。沿管

34、壁徐徐加入约0.5ml的吲哚（靛基的吲哚（靛基质）试剂于培养物中，若见试剂与培养基的接触面质）试剂于培养物中，若见试剂与培养基的接触面出现红色，则试验为阳性；若不出现红色，则试验出现红色，则试验为阳性；若不出现红色，则试验为阴性，记录结果。为阴性，记录结果。2.硫化氢试验：硫化氢试验：取醋酸铅培养基二支，分别接种大取醋酸铅培养基二支，分别接种大肠杆菌与变形杆菌或乙型副伤寒杆菌，种毕，置肠杆菌与变形杆菌或乙型副伤寒杆菌，种毕，置37培养培养1824h。取出观察结果，按下列符号记。取出观察结果，按下列符号记录：录：+：出现黑色，表示产生硫化氢。：颜色不变，表：出现黑色，表示产生硫化氢。：颜色不变，

35、表示不产生硫化氢。示不产生硫化氢。（三）尿素分解试验（三）尿素分解试验尿素培养基的主要成分：尿素水溶液、葡萄糖、蛋白胨、尿素培养基的主要成分：尿素水溶液、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、酚红（指示剂）。培养基呈淡红色。磷酸二氢钾、酚红（指示剂）。培养基呈淡红色。某些细菌（如变形杆菌）具有尿素分解酶，能分解尿素形某些细菌（如变形杆菌）具有尿素分解酶，能分解尿素形成大量的氮，使培养基变碱性，指示剂呈红色（阳性反应）成大量的氮，使培养基变碱性，指示剂呈红色（阳性反应）；不分解尿素者（如伤寒杆菌），培养基颜色不变（阴性；不分解尿素者（如伤寒杆菌），培养基颜色不变（阴性反应）。尿素培养基中含有的葡萄糖、蛋白

36、胨，供作接种反应）。尿素培养基中含有的葡萄糖、蛋白胨，供作接种菌的营养物，两者的量有一定比例，使分解葡萄糖生成的菌的营养物，两者的量有一定比例，使分解葡萄糖生成的酸和分解蛋白胨生成的碱性化合物基本相互抵消；同时培酸和分解蛋白胨生成的碱性化合物基本相互抵消；同时培养基中尚有磷酸二氢钾缓冲剂的存在，故此两物质对培养养基中尚有磷酸二氢钾缓冲剂的存在，故此两物质对培养基的酸碱度影响不大。如接种的细菌分解葡萄糖产酸过多，基的酸碱度影响不大。如接种的细菌分解葡萄糖产酸过多，使使pH值下降，也可使培养基颜色变黄。值下降，也可使培养基颜色变黄。取尿素培养基二支，分别接种伤寒杆菌和变形杆菌，置取尿素培养基二支，

37、分别接种伤寒杆菌和变形杆菌，置37培养培养1824h，观察结果并作记录。，观察结果并作记录。（四）色素的产生（四）色素的产生取普通琼脂斜面（或平碟）培养基取普通琼脂斜面（或平碟）培养基2支支（个），分别接种金黄色葡萄球菌和绿（个），分别接种金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌于培养基上，种毕，放脓杆菌于培养基上，种毕，放37培养培养1824h取出观察是否有色素产生，并取出观察是否有色素产生，并作记录。作记录。【实验作业】【实验作业】1写出各种培养基制备的方法。写出各种培养基制备的方法。2写出三种培养基的用途。写出三种培养基的用途。3.记录细菌在普通平板记录细菌在普通平板,液体培养基液体培养基,半固半固体培

38、养基中的生长现象。体培养基中的生长现象。4.说明在接种细菌时要注意哪些无菌操说明在接种细菌时要注意哪些无菌操作。作。实验三实验三 细菌的检查及消毒灭菌（操作）细菌的检查及消毒灭菌（操作）【实验目的】【实验目的】1.掌握：掌握：无菌操作技术。无菌操作技术。2.熟悉：熟悉：高压灭菌器的使用及使用注意高压灭菌器的使用及使用注意事项；紫外线灭菌。事项；紫外线灭菌。3.了解：了解：细菌的接种技术；药敏试验在细菌的接种技术；药敏试验在临床应用的实际意义。临床应用的实际意义。【实验内容及方法】【实验内容及方法】一、细菌的分布检查一、细菌的分布检查二、咽喉部细菌的检查及皮肤消毒试验二、咽喉部细菌的检查及皮肤消

39、毒试验三、常用消毒灭菌器介绍（示教）三、常用消毒灭菌器介绍（示教）四、药物敏感试验（纸片法）（示教）四、药物敏感试验（纸片法）（示教）一、细菌的分布检查一、细菌的分布检查（一）空气中细菌的检查（一）空气中细菌的检查取普通琼脂平板取普通琼脂平板2个，分别置于实验室内个，分别置于实验室内和消毒过的无菌室或超净工作台上，打和消毒过的无菌室或超净工作台上，打开平皿盖暴露开平皿盖暴露10分钟，盖上平皿盖，做分钟，盖上平皿盖，做好标记，好标记，37培养培养24小时后观察结果。小时后观察结果。（二）水中细菌分布检查（二）水中细菌分布检查倾注平板分离法倾注平板分离法1取已灭菌的取已灭菌的1毫升吸管，套上胶头。

40、毫升吸管，套上胶头。2右手持吸管带胶头的一端，其余部分迅速通过火焰外焰，右手持吸管带胶头的一端，其余部分迅速通过火焰外焰，以再灭除吸管表面可能存在的细菌。以再灭除吸管表面可能存在的细菌。3以挤压胶头的办法，吸取以挤压胶头的办法，吸取1ml自来水，置于无菌空平皿自来水，置于无菌空平皿中（注意不要错放入平碟盖内）。中（注意不要错放入平碟盖内）。4取一瓶已融化并冷却至取一瓶已融化并冷却至50左右（手握琼脂管感觉热而左右（手握琼脂管感觉热而不烫手）的琼脂培养基，取去硅胶塞，管口通过火焰外焰不烫手）的琼脂培养基，取去硅胶塞，管口通过火焰外焰灭菌，迅速倾入已盛有灭菌，迅速倾入已盛有1ml自来水的平皿中，立

41、即加上平自来水的平皿中，立即加上平皿盖，在实验台上轻轻水平摇动，使琼脂与水样充分混合，皿盖，在实验台上轻轻水平摇动，使琼脂与水样充分混合，静置台面，等待琼脂凝固。静置台面，等待琼脂凝固。5琼脂凝固后，将平皿倒放（即平皿底在上，盖在下）。琼脂凝固后，将平皿倒放（即平皿底在上，盖在下）。置于置于37温箱培养温箱培养1824h，取出观察结果。计算每毫升，取出观察结果。计算每毫升自来水菌落数，对结果给予评价。自来水菌落数，对结果给予评价。二、咽喉部细菌的检查及皮肤消毒试验二、咽喉部细菌的检查及皮肤消毒试验（一）咽喉部细菌的检查（一）咽喉部细菌的检查取血平板取血平板1个，在平皿底部正中画一直线分为两部个

42、，在平皿底部正中画一直线分为两部分，分别做好标记，由两位同学用无菌操作分别将分，分别做好标记，由两位同学用无菌操作分别将咽喉部棉拭子标本涂于血平皿表面的相应位置，然咽喉部棉拭子标本涂于血平皿表面的相应位置，然后再用接种环画线分离，后再用接种环画线分离，37培养培养24h后观察结果后观察结果（注意是否有细菌菌落、菌苔及溶血环）。（注意是否有细菌菌落、菌苔及溶血环）。（二）皮肤消毒试验（二）皮肤消毒试验每两名学生用一个琼脂平皿，先在平皿底部帖上标每两名学生用一个琼脂平皿，先在平皿底部帖上标签纸，纸上分签纸，纸上分5格，标明序号，两人用未消毒手指格，标明序号，两人用未消毒手指分别在分别在1、2格内涂

43、布，然后用格内涂布，然后用2%碘酊消毒手指后碘酊消毒手指后再分别涂抺再分别涂抺3、4格，余下第格，余下第5格作为空白对照，盖格作为空白对照，盖上皿盖，置上皿盖，置37温箱培养温箱培养24h后观察结果。后观察结果。三、常用消毒灭菌器介绍（示教）三、常用消毒灭菌器介绍（示教）（一）高压蒸汽灭菌器（一）高压蒸汽灭菌器（二）干烤箱（干热灭菌器）（二）干烤箱（干热灭菌器）（三）紫外线杀菌试验（三）紫外线杀菌试验（一）高压蒸汽灭菌器（一）高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器是应用最广的灭菌器，凡能耐高温高压蒸汽灭菌器是应用最广的灭菌器，凡能耐高温不怕潮湿的普通培养基、敷料、手术器械、药品、不怕潮湿的普通培养基、敷

44、料、手术器械、药品、注射用液体和玻璃器皿等，均可用此法灭菌。注射用液体和玻璃器皿等，均可用此法灭菌。1.高压蒸汽灭菌器的构造：高压蒸汽灭菌器的构造：手提式蒸汽灭菌器是一手提式蒸汽灭菌器是一双层金属圆桶。外层坚厚，能承受一定的压力，外双层金属圆桶。外层坚厚，能承受一定的压力，外层顶端有金属厚盖。有的灭菌器盖旁加有螺旋，借层顶端有金属厚盖。有的灭菌器盖旁加有螺旋，借以紧闭此盖，有的则借助弹力将盖顶上，防止蒸汽以紧闭此盖，有的则借助弹力将盖顶上，防止蒸汽外溢。盖上装有排气阀门、内连通气管、安全活塞外溢。盖上装有排气阀门、内连通气管、安全活塞和温度压力表。内层金属筒的内壁有安置通气管的和温度压力表。内

45、层金属筒的内壁有安置通气管的金属槽。（见实验图金属槽。（见实验图31）实验图实验图3 31 1手提式高压蒸汽灭菌器示意图手提式高压蒸汽灭菌器示意图2.高压蒸汽灭菌器使用法：高压蒸汽灭菌器使用法：（1）先在外层内加适当的水，然后放入内层金属筒。将待灭）先在外层内加适当的水，然后放入内层金属筒。将待灭菌物品放入内层金属筒里，加盖，注意要把盖上的通气管放入菌物品放入内层金属筒里，加盖，注意要把盖上的通气管放入内壁金属槽内。旋紧螺旋使之密闭，同时打开排气阀门。内壁金属槽内。旋紧螺旋使之密闭，同时打开排气阀门。（2）放炉上加热或插上电源。）放炉上加热或插上电源。（3）温度逐渐上升时，装入的水汽化，随着压

46、力的增高，迫）温度逐渐上升时，装入的水汽化，随着压力的增高，迫使器内冷空气先由排气阀驱出，继则有蒸汽出现，待有大量蒸使器内冷空气先由排气阀驱出，继则有蒸汽出现，待有大量蒸汽喷出时（呈白色雾状气流，并发出哨音）即可认为器内冷空汽喷出时（呈白色雾状气流，并发出哨音）即可认为器内冷空气已被排尽。气已被排尽。（4）关闭排气阀门，此后器内压力逐渐升高。随着蒸汽压力）关闭排气阀门，此后器内压力逐渐升高。随着蒸汽压力的增高，内部温度也随之升高。温度随压力升高的情况见实验的增高，内部温度也随之升高。温度随压力升高的情况见实验表表3-1。直到压力表指示到。直到压力表指示到103kpa(15磅吋磅吋2)时，器内温

47、度时，器内温度可达到可达到121.3。此时调节热源使压力和温度维持在此数值，。此时调节热源使压力和温度维持在此数值，维持维持1520min，即可达到灭菌的目的。，即可达到灭菌的目的。（5）灭菌时间达到后，停止加热，待压力自行下降至零时，才）灭菌时间达到后，停止加热，待压力自行下降至零时，才能开盖取物。能开盖取物。3.使用高压蒸汽灭菌器注意事项：使用高压蒸汽灭菌器注意事项：（1）灭菌开始时，必须将器内冷空气完全排除，）灭菌开始时，必须将器内冷空气完全排除，否则压力表上所示压力不完全是蒸汽压力，灭菌将否则压力表上所示压力不完全是蒸汽压力，灭菌将不彻底。不彻底。（2）灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门

48、放气减）灭菌完毕，切不可突然打开排气阀门放气减压，以免灭菌的瓶内液体因压力突然降低后冲出外压，以免灭菌的瓶内液体因压力突然降低后冲出外溢。溢。（3）放置需灭菌的物品不应太挤。根据物品体积）放置需灭菌的物品不应太挤。根据物品体积的大小或污染的情况可适当调整灭菌时间。总之用的大小或污染的情况可适当调整灭菌时间。总之用高压蒸汽灭菌器灭菌时，要做到高压蒸汽灭菌器灭菌时，要做到“安全生产安全生产”。（二）干烤箱（干热灭菌器）（二）干烤箱（干热灭菌器）干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石棉，干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石棉，箱底有热源（电炉），并附有温度计和自动调节器。箱底有热源（电炉）

49、，并附有温度计和自动调节器。灭菌时，加热箱内空气，靠热空气灭菌。主要用于灭菌时，加热箱内空气，靠热空气灭菌。主要用于耐高温，怕潮湿的物品灭菌。如玻璃器皿、试管、耐高温，怕潮湿的物品灭菌。如玻璃器皿、试管、吸管、三角烧杯、油剂、粉剂等灭菌。用时将需灭吸管、三角烧杯、油剂、粉剂等灭菌。用时将需灭菌的物品经清洗和晾干之后，整齐排放在箱内，不菌的物品经清洗和晾干之后，整齐排放在箱内，不宜过挤，关闭两层箱门，通电，排冷气后关上排气宜过挤，关闭两层箱门，通电，排冷气后关上排气孔，待温度升到孔，待温度升到160170，维持，维持2h，可达到灭，可达到灭菌目的。灭菌完毕，关闭电源，待温度自然下降至菌目的。灭菌

50、完毕，关闭电源，待温度自然下降至50以下才能开门取物，以防玻璃器皿骤冷发生以下才能开门取物，以防玻璃器皿骤冷发生爆裂。爆裂。（三）紫外线杀菌试验（三）紫外线杀菌试验原理：原理：紫外线在波长紫外线在波长200nm300nm时具时具有杀菌能力，但穿透力不强，可被普通玻璃有杀菌能力，但穿透力不强，可被普通玻璃及纸片所吸收。及纸片所吸收。用途：用途：常用于手术室、无菌常用于手术室、无菌室、病房、治疗室等的空气消毒。室、病房、治疗室等的空气消毒。取普通琼脂平板一个，均匀密集画线接种大取普通琼脂平板一个，均匀密集画线接种大肠杆菌，用无菌镊子把经灭菌的方形纸片帖肠杆菌，用无菌镊子把经灭菌的方形纸片帖于平板表