实验4-离心和免疫-金彩霞(00001)课件.ppt

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1、实验实验4 离心分离技术与淋巴细胞分离离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定及鉴定单个核个核细胞的分离和胞的分离和B淋巴淋巴细胞数量胞数量检测实验目的与要求目的与要求了解离心分离技了解离心分离技术的原理与分的原理与分类掌握掌握应用密度梯度离心法分离用密度梯度离心法分离单个核个核细胞及胞及B淋巴淋巴细胞胞鉴定的方法定的方法实验原理原理离心力：离心力：指由于物体旋指由于物体旋转而而产生脱离旋生脱离旋转中心中心的力。的力。离心离心:利用利用离心力离心力将将悬浮液中的浮液中的悬浮微粒快浮微粒快 速沉降，借以分离比重不同的各种物速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的成分的方法。方法。离心力离心力公式：公式：

2、Fc=macm2rFc:离心力离心力;m:颗粒的粒的质量量;ac:离心加速度离心加速度;:转子的角速度子的角速度（rad/s）；）；r：旋：旋转半径半径(cm)表示表示单位：位：转子每分子每分钟的的转数数（r/min,RPM）表示，如）表示，如4000rpm；相相对离心力离心力(RelativeCentrifugalForce，RCF)来表示，来表示，实际离心离心力力转化化为重力加速度的倍数；重力加速度的倍数；RCF=Fc/Fg=m2r/mg=2r/g=2n/60)2r/g=1.1210-5n2rn:转子每分子每分钟转数数(rpm);r:旋旋转半径半径(cm);g:重力加速重力加速980.6c

3、m2/s2(旋旋转一周等于一周等于2弧度弧度)g表示：表示：F(g)=r(r/min)21.11810-5由此可由此可见，离心力的大小与，离心力的大小与转速的平方及与旋速的平方及与旋转半径成正比半径成正比按按转速分：速分：低速、高速和超速三种低速、高速和超速三种 离心机按用途：离心机按用途：分析用、制分析用、制备用两种用两种 离心机分离心机分类低速离心机低速离心机其最大转速在6000rpm以内，相对离心力（RCF）在104g以下，主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，和粗结晶等较大颗粒。高速离心机高速离心机高速离心机的转速为60002.5x104rpm，相对离心力达1x1041x1

4、05g，主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。超速离心机超速离心机超速离心机的转速超过3.0 x104rpm，最大相对离心力超过5x105g，主要用于亚细胞结构的分离制备和生物大分子的制备。离心机分离心机分类离心方法分类离心方法分类分级离心法分级离心法密度梯度离心法密度梯度离心法速率区带离心法速率区带离心法等比重梯度离心法等比重梯度离心法超速离心法超速离心法p沉降系数沉降系数是指在是指在单位离心力的作用下粒子的沉降速度，即微粒在位离心力的作用下粒子的沉降速度，即微粒在离心力的作用下，从静止状离心力的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的到达极限速度所需要的时间。以。以Svedber

5、g表示，表示，简称称S,单位秒，位秒，1S=1x10-13s。实验一、一、单个核个核细胞的分离胞的分离用比重与被分离用比重与被分离细胞比重相近的胞比重相近的细胞分离液胞分离液则可通可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的要的单个核个核细胞（鼠的胞（鼠的单个核个核细胞比重胞比重1.088，人的，人的个核个核细胞比重胞比重1.075）。）。人红细胞密度为人红细胞密度为1.093粒细胞为粒细胞为1.092淋巴细胞为淋巴细胞为1.0770.001单个核个核细胞的分离胞的分离免免疫疫系系统中枢免疫中枢免疫组织和器官和器官骨髓骨髓胸腺胸腺T细胞分化、胞

6、分化、发育和成熟的主要器官育和成熟的主要器官各各类血血细胞和免疫胞和免疫细胞胞发生的生的场所所B细胞分化成熟的胞分化成熟的场所所体液免疫体液免疫应答答发生的生的场所所脾脾外周免疫外周免疫组织和器官和器官淋巴淋巴结粘膜免疫系粘膜免疫系统T细胞（胞（75%)和和B细胞胞(25%)定居的定居的场所所T细胞（胞（40%)和和B细胞胞60%)定居的定居的场所所参与淋巴参与淋巴细胞再循胞再循环免疫免疫应答答发生的生的场所所过滤作用作用免疫免疫应答答发生的生的场所所过滤作用作用合成某些生物活性物合成某些生物活性物质单个核个核细胞的分离胞的分离常用的淋巴常用的淋巴细胞分离液：胞分离液：聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺液

7、（又称泛影葡胺液（又称Ficoll）泛影葡胺泛影葡胺-右旋糖右旋糖酐液（又称液（又称Dextran）聚蔗糖聚蔗糖:商品名商品名Ficoll，常采用，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量也就是相对分子重量为为400000，低渗透压，高粘度，为此常与泛影葡胺混合使用以，低渗透压，高粘度，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。肿瘤细胞、鼠肝细胞等。操作步操作步骤5.离心后小心取出离心后小心取出试管，仔管，仔细观察察细胞分胞分层，试管底管底层为红色色的的红细胞，依次向上胞，依次

8、向上为细胞分离液和生理胞分离液和生理盐水，在此之水，在此之间可可见一一层淡淡地白色淡淡地白色细胞胞层。6.用尖吸管小心取出中用尖吸管小心取出中层间的的细胞到另一胞到另一洁净离心管，并加离心管，并加2ml生理生理盐水洗水洗涤一次，一次，1500rpm离心离心5分分钟后去上清。后去上清。7.再将再将细胞均匀胞均匀悬浮于浮于0.1ml生理生理盐水中，取出水中，取出10l滴于黏附滴于黏附剂处理的理的载玻片上，自然干燥后，可玻片上，自然干燥后，可进行行细胞胞类型型鉴定。定。单个核个核细胞的分离胞的分离脾脾脏单个核个核细胞的分离胞的分离淋巴淋巴细胞的胞的鉴定定-B淋巴淋巴细胞数量胞数量检测mIgMB细胞的

9、抗原胞的抗原识别受体受体B细胞特异的表面胞特异的表面标志志用直接免疫用直接免疫组化染色法化染色法用用过氧化物氧化物酶标记的抗的抗IgM，在一定条件下与淋，在一定条件下与淋巴巴细胞混合，胞混合，标记的抗的抗IgM抗体可以与抗体可以与B细胞表面胞表面的的IgM结合，通合，通过DAB显色，在普通光学色，在普通光学显微微镜下下观察可察可见细胞膜上出胞膜上出现特定染色。特定染色。实验原理实验原理过氧化物氧化物酶标记Anti-IgMantibodyDABmIgM免疫免疫组织化学染色法化学染色法蓝紫色沉淀紫色沉淀过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法评价：价：简单易行、特异性高、快速方便，常易行、特异性高、快速方

10、便，常用于用于肾活活检组织几种免疫球蛋白的几种免疫球蛋白的检测和病原体的和病原体的检测。但其不足是只能。但其不足是只能检测相相应的一种物的一种物质，敏感性，敏感性较差差.间接法接法评价：价：由于由于结合在抗原抗体复合物上的合在抗原抗体复合物上的荧光光素抗体增多，素抗体增多，发出的出的荧光亮度光亮度强，因而其敏感性，因而其敏感性强。目前本法目前本法应用用较广泛，只需制广泛，只需制备一种种属一种种属荧光抗体，光抗体，即可适用于多种第一抗体的即可适用于多种第一抗体的标记显示。缺点是容易出示。缺点是容易出现非特异性反非特异性反应。操作步操作步骤1.采用采用颈椎脱臼法椎脱臼法处死小鼠，解剖取出脾死小鼠，

11、解剖取出脾脏，分离出，分离出单个核个核细胞胞并取出并取出10l滴于黏附滴于黏附剂处理的理的载玻片左右各一滴，涂片，自然玻片左右各一滴，涂片，自然干片。干片。2.在室温条件下，用甲醇固定在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔胞，自然干燥后用蜡笔标出出细胞胞范范围，蒸，蒸馏水洗三次。水洗三次。3.配制封配制封闭液（在含有液（在含有6ul双氧水的双氧水的Ep管中加入管中加入1ml含含10%兔血清兔血清的的PBS)。室温浸泡。室温浸泡30分分钟，PBS洗洗3次。次。4.滴加适当稀滴加适当稀释（1:100）的）的过氧化物氧化物酶标记的兔抗小鼠的兔抗小鼠IgM抗体抗体于左于左侧涂片，滴加适量的封涂

12、片，滴加适量的封闭液于右液于右侧涂片（做阴性涂片（做阴性对照），照），置于湿盒中，于置于湿盒中，于37恒温箱中孵育恒温箱中孵育1小小时，PBS洗洗2分分钟3次。次。5.滴加适当稀滴加适当稀释的的DAB显色液，室温色液，室温显色色30分分钟，蒸，蒸馏水洗水洗3次，次，干片后，干片后，显微微镜下下观察。察。注意事注意事项1.在滴在滴DAB显色液前要色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性底去除游离的抗体，以免假阳性结果。果。2.DAB，即，即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride二氨基二氨基联苯胺或苯胺或联苯二胺，分子式苯二胺，分子式为C12H14N44HC

13、l，分子量，分子量为360.11,是辣根是辣根过过氧化物氧化物酶酶的常用底物。在辣根的常用底物。在辣根过过氧化物氧化物酶酶的催的催化下，化下，DAB会会产产生棕色沉淀生棕色沉淀（本次（本次试验为紫紫蓝色）。色）。该该沉淀不沉淀不溶于水和乙醇。因此在溶于水和乙醇。因此在DAB显显色后，色后，还还可以使用溶于乙醇的染料可以使用溶于乙醇的染料进进行后行后续续染色染色。3.DAB潜在致突潜在致突变作用作用，请请注意适当防注意适当防护护,请穿穿实验服并戴一次性服并戴一次性手套操作手套操作。思考思考题在哪个界面中在哪个界面中获得得较多的淋巴多的淋巴细胞？胞？单个核个核细胞胞层主要包括哪些主要包括哪些细胞？胞？封封闭液中加双氧水的目的是什么？封液中加双氧水的目的是什么？封闭液主要液主要封封闭哪些不想要的信号？哪些不想要的信号？