基因工程的基本工具和基本操作程序课件.ppt

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1、基因工程的基本工具基因工程的基本工具和基本操作程序和基本操作程序安福二中 王宇清高频考点突破高频考点突破考点一考点一 基因工程的概念理解和理论基础基因工程的概念理解和理论基础1.1.基因工程的概念理解基因工程的概念理解 (1)(1)操作环境：体外操作环境：体外关键步骤关键步骤“表达载体的构表达载体的构 建建”的环境。的环境。(2)(2)操作水平：分子水平。操作水平：分子水平。(3)(3)原理原理:基因重组。基因重组。(4)(4)优点优点 与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。与诱变育种相比：定向改造生物性状。与诱变育种相比：定向改造生物性状。(5)(5

2、)本质本质:甲甲(供体提供目的基因供体提供目的基因)乙乙(受体表达受体表达 目的基因目的基因),),即基因未变、合成蛋白质未变即基因未变、合成蛋白质未变,只是合只是合 成场所的转移。成场所的转移。2.2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图基因工程的基本原理和理论基础概括如下图 提提醒醒 若若题题目目强强调调“目目的的基基因因”的的表表达达过过程程,则则 只只 包包 括括“转转录录和和翻翻译译”两两个个过过程程,不不包包括括目目的的基基因因的的 复制。复制。考点二考点二 基因工程的操作工具基因工程的操作工具1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”(1)(1)来源来源:

3、主要是从原核生物中分离纯化出来的。主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)(2)化学本质：蛋白质。化学本质：蛋白质。(3)(3)作用作用 (4)(4)作用特点：特异性作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。切割特定位点。(5)(5)切割方式切割方式(6)(6)切割部位：磷酸二酯键切割部位：磷酸二酯键催化作用催化作用,所以可重复利用所以可重复利用可用于可用于DNADNA的切割获取目的基因和载体的切割的切割获取目的基因和载体的切割错位切：产生两个相同的黏性末端错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端平切：形成平末端 提醒提醒 切割

4、的化学键为磷酸二酯键。切割的化学键为磷酸二酯键。在在 切切 割割 目目 的的 基基 因因 和和 载载 体体 时时 要要 求求 用用 同同 一一 种种 限限 制制 酶酶,目的是产生相同的黏性末端。目的是产生相同的黏性末端。将将一一个个基基因因从从 D DN NA A 分分子子上上切切割割下下来来,产产生生两两个个切切口口,同同时时形形成成四四个个粘粘性性末末端端,切切割割载载体体产产生生一一个个切切口口，形形成成两两个个粘粘性性末末端端。不不 同同 D DN NA A 分分 子子 用用 同同 一一 种种 限限 制制 酶酶 切切 割割 产产 生生 的的 黏黏 性性 末末 端端 都都 相相 同同,同

5、同 一一 个个 D DN NA A 分分 子子 用用 不不 同同 的的 限限 制制 酶酶 产产 生生 的的 黏性末端不相同。黏性末端不相同。2.DNA2.DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”常用类型常用类型E Ecoli coli DNADNA连接连接酶酶T T4 4 DNADNA连接酶连接酶来源来源大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体功能功能连接黏性末端连接黏性末端连接黏性末端或连接黏性末端或平末端平末端结果结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键的磷酸二酯键 拓展提升拓展提升 DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较

6、DNA DNA 连接酶连接酶DNA DNA 聚合酶聚合酶作用实质作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键键是否需模板是否需模板不需要不需要需要需要连接连接DNADNA链链双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNADNA片段之片段之间形成磷酸二酯键间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的存在的核酸片段的33端的羟基上端的羟基上,形成磷酸形成磷酸二酯键二酯键作用结果作用结果将两个将两个 DNA DNA片段连片段连接成重组接成重组 DNA DNA分子分子合成新的合成新的DNADNA分子分子3.3.基因进入受体细胞的载体

7、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”(1)(1)类型类型 提醒提醒 质粒本质是质粒本质是DNA,DNA,不是细胞器不是细胞器;特点特点:小小 型环状。型环状。(2)(2)功能：将目的基因导入受体细胞。功能：将目的基因导入受体细胞。(3)(3)应具备条件应具备条件 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；有一个至多个限制酶的切割位点有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源以便于与外源 基因连接；基因连接；有特殊的遗传标记基因有特殊的遗传标记基因,供重组供重组DNADNA的检测和鉴定。的检测和鉴定。最常用载体最常用载体:质粒质粒其他载体其他载体:噬菌体的衍生

8、物、动植物病毒等噬菌体的衍生物、动植物病毒等 提提醒醒 一一般般来来说说,天天然然载载体体往往往往不不能能满满足足人人类类的的 所所有有要要求求,因因此此人人们们根根据据不不同同的的目目的的和和需需要要,对对 某某 些天然的载体进行人工改造。些天然的载体进行人工改造。常常见见的的标标记记基基因因有有抗抗生生素素基基因因、产产生生特特定定颜颜色色 的表达产物基因、发光基因等。的表达产物基因、发光基因等。作作为为载载体体必必须须具具有有多多个个限限制制酶酶切切点点,而而且且每每种种酶酶 的的切切点点最最好好只只有有一一个个。因因为为某某种种限限制制酶酶只只能能识识别别 单单一一切切点点,若若载载体

9、体上上有有一一个个以以上上的的酶酶切切点点,则则切切割割 重重组组后后可可能能丢丢失失某某些些片片段段,若若丢丢失失的的片片段段含含复复制制起起 点点 区区,则则进进入入受受体体细细胞胞后后便便不不能能自自主主复复制制。一一个个载载 体体若若只只有有某某种种限限制制酶酶的的一一个个切切点点,则则酶酶切切后后既既能能把把 环打开接纳外源环打开接纳外源DNADNA片段片段,又不会丢失自己的片段。又不会丢失自己的片段。注注意意与与细细胞胞膜膜上上载载体体的的区区别别,两两者者的的化化学学本本质质和和 作用都不相同。作用都不相同。质质粒粒能能自自我我复复制制,既既可可在在自自身身细细胞胞、受受体体细细

10、胞胞也也 可在体外复制。可在体外复制。考点三考点三 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.基因工程图解基因工程图解:抗虫棉的培育过程抗虫棉的培育过程二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取目的基因的获取(1)目的基因：指编码蛋白质的目的基因：指编码蛋白质的 。(2)获取目的基因的方法获取目的基因的方法从基因文库从基因文库(基因组文库或基因组文库或cDNA文库文库)中获取中获取a基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多多 ，导入，导入 的群体中储存，各个受体菌分的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基

11、因，称为基因文库。别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。结构基因结构基因受体菌受体菌DNA片段片段文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中启动子基因中启动子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的物种之间的基因交流基因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基基因因文文库库的的组组建建过过程程就就包包含含基基因因工工程程的的基基本本操操作作步步骤骤。从从基基因因文文库库中中获获取取目目的的基基因因的的优优点点是是操操作作简简便便,缺缺点点是是

12、工工作作量量大大,具具有有一一定定的的盲目性盲目性b.基因文库的种类基因文库的种类c目的基因的获取依据：目的基因的获取依据：()基因的基因的 序列；序列；()基因的功能；基因的功能；()基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置；()基因的基因的 产物产物mRNA；()基因的翻译产物蛋白质。基因的翻译产物蛋白质。核苷酸核苷酸转录转录 人工合成目的基因人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和常用的方法有化学合成法和 反转录法。反转录法。化学合成法化学合成法:蛋白质蛋白质 氨基酸序列氨基酸序列 RNA RNA 碱基序列碱基序列 DNA DNA碱基序列碱基序列 用用4 4种脱氧核种脱氧核 苷酸人工

13、合成目的基因苷酸人工合成目的基因 反转录法反转录法:分离出供体细胞分离出供体细胞mRNA mRNA 单链单链DNADNA 合成目的基因合成目的基因 分析分析推测推测推测推测逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因aPCR的含义：是一项在生物体外的含义：是一项在生物体外 特定特定DNA片段的核酸合成技术。片段的核酸合成技术。b目的：获取大量的目的基因目的：获取大量的目的基因c原理：原理：DNA复制复制d前提条件：有一段已知目的基因的前提条件：有一段已知目的基因的 和根据该序列合成的和根据该序列合成的 e过程：目的基因受热形成过程：目的基因受热形成 ，

14、与引物，与引物结合，在结合，在 的作用下延伸形成的作用下延伸形成DNA。f方式：指数扩增方式：指数扩增2n(n为扩增循环的次数为扩增循环的次数)复制复制核苷酸序列核苷酸序列单链单链DNADNA聚合酶聚合酶引物PCRPCR扩增技术与扩增技术与DNADNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理DNADNA复制复制(碱基互补配对碱基互补配对)原料原料四种游离的脱氧核苷酸四种游离的脱氧核苷酸条件条件模板、模板、ATPATP、酶、原料、引物、酶、原料、引物不不同同点点解旋解旋方式方式DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化场所场所体外复制

15、体外复制(PCR(PCR扩增仪扩增仪)主要在细胞核内主要在细胞核内酶酶热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶)细胞内含有的细胞内含有的DNADNA聚合酶聚合酶结果结果在短时间内形成大量的在短时间内形成大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子基因表达载体的构建基因表达载体的构建最核心步骤最核心步骤（）表达载体的功能（）表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 给下给下一代。一代。使目的基因使目的基因 和发挥作用。和发挥作用。（）基因表达载体的组成（）基因表达载体的组成:启动子目的基因终止子启动子目的基因终止

16、子标记基因。标记基因。遗传遗传表达表达启动子：位于基因的启动子：位于基因的 ，它是，它是 识识别和结合的部位，驱动基因转录产生别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。终止子：位于基因的尾端，终止终止子：位于基因的尾端，终止 。标记基因：标记基因：是否含有目的基因。是否含有目的基因。（）基因表达载体的构建方法（）基因表达载体的构建方法 提提醒醒 该该过过程程把把三三种种工工具具(只只有有两两种种工工具具酶酶)全全 用用 上了上了,是最核心、最关键的一步是最核心、最关键的一步,在体外进行。在体外进行。mRNA的转录的转录鉴别受体细胞鉴别受体细胞首端首端RNA聚合酶聚合酶3将目的基因导入受体细胞将

17、目的基因导入受体细胞转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持细胞内维持 的过程。的过程。(1)将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞方法：方法：农杆菌转化法农杆菌转化法a农杆菌特点：易感染农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力；对大多数单子叶植物没有感染能力；Ti质粒的质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。上。b转化过程：转化过程：将目的基因插入将目的基因插入转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合到受体细胞的整合到

18、受体细胞的DNADNA上。上。基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法双子叶双子叶TDNATiTi质粒的质粒的T TDNADNA上上稳定和表达稳定和表达(2)将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法：方法：注射技术。注射技术。操作程序：操作程序：将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵获得获得显微注射显微注射早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为具有新性状的动物发育成为具有新性状的动物。(3)将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞微生物作为受体细胞特点：个体微小，代谢旺盛，微生物作为受体细胞特点：个体微小，代谢旺盛，获得目的基因产物多。，获得

19、目的基因产物多。转化：转化：处理细胞处理细胞重组重组表达载体分子与感受态细胞混合表达载体分子与感受态细胞混合促进感受态促进感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子。分子。提醒提醒 唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。显微显微用用Ca2繁殖速度快繁殖速度快受精卵受精卵感受态细胞感受态细胞 (4)(4)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定解题思路探究解题思路探究思维误区警示思维误区警示易错分析易错分析 基因工程中易错点辨析不清基因工程中易错点辨析不清 (1)(1)基因工程中有基因工程中有3 3种工具种工具,但工具酶只有但工具酶只有2 2种。种。(2)(2)工具酶本质

20、为蛋白质工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型载体本质为小型DNADNA分分子子,但不一定是环状。但不一定是环状。(3)(3)标记基因的作用标记基因的作用筛选、检测目的基因是筛选、检测目的基因是否导入受体细胞否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基常见的有抗生素抗性基因、发光基因因,表达产物为带颜色物质等。表达产物为带颜色物质等。(4)(4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织经组织培养培养)、动物受精卵、动物受精卵(一般不用体细胞一般不用体细胞)、微生物、微生物大肠杆菌、酵母菌等大肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性但要合成糖蛋白、有生物活性的胰

21、岛素则必需用真核生物酵母菌的胰岛素则必需用真核生物酵母菌需内质网、高需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营原因是它营寄生生活寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它原因是它无细胞核无细胞核,不能合成蛋白质。不能合成蛋白质。1、许多人企求着生活的完美结局，殊不知美根本不在结局，而在于追求的过程。2、慢慢的才知道：坚持未必就是胜利，放弃未必就是认输，。给自己一个迂回的空间，学会思索，学会等待，学会调整。人生没有假设，当下即是全部。背不动的，放下了；伤不起的，看淡了；想不通的，不想了；恨不过的，抚平了。3、在比

22、夜更深的地方，一定有比夜更黑的眼睛。4、一切伟大的行动和思想，都有一个微不足道的开始。5、从来不跌倒不算光彩，每次跌倒后能再站起来，才是最大的荣耀。6、这个世界到处充满着不公平，我们能做的不仅仅是接受，还要试着做一些反抗。7、一个最困苦、最卑贱、最为命运所屈辱的人，只要还抱有希望，便无所怨惧。8、有些人，因为陪你走的时间长了，你便淡然了，其实是他们给你撑起了生命的天空；有些人，分开了，就忘了吧，残缺是一种大美。9、照自己的意思去理解自己，不要小看自己，被别人的意见引入歧途。10、没人能让我输，除非我不想赢！11、花开不是为了花落，而是为了开的更加灿烂。12、随随便便浪费的时间，再也不能赢回来。13、不管从什么时候开始，重要的是开始以后不要停止；不管在什么时候结束，重要的是结束以后不要后悔。14、当你决定坚持一件事情，全世界都会为你让路。15、只有在开水里，茶叶才能展开生命浓郁的香气。16、别想一下造出大海，必须先由小河川开始。17、不要让未来的你，讨厌现在的自己，困惑谁都有，但成功只配得上勇敢的行动派。18、人生最大的喜悦是每个人都说你做不到，你却完成它了！19、如果你真的愿意为自己的梦想去努力，最差的结果，不过是大器晚成。20、不忘初心，方得始终。