微生物学检验细菌的培养与分离技术课件.ppt

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1、细菌的培养与分离技术细菌的培养与分离技术培养基培养基常用玻璃器材的准备常用玻璃器材的准备培养基的成分和作用培养基的成分和作用培养基的种类培养基的种类培养基的制备培养基的制备常用玻璃器材的准备常用玻璃器材的准备玻璃器材的种类及用途玻璃器材的种类及用途玻璃器材的清洗玻璃器材的清洗新购置的玻璃器材：新购置的玻璃器材：12盐酸浸泡盐酸浸泡清水清水清洗清洗用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷清水清洗清水清洗细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷盛培养基试管和平皿：高压灭菌盛培养基试管和平皿：高压灭菌趁热倒出趁热倒出洗涤剂洗刷洗涤剂洗刷清水冲洗清水冲洗吸管：吸

2、管：3来苏浸泡来苏浸泡清水冲洗清水冲洗玻片和盖玻片：玻片和盖玻片：3来苏和清洁液浸泡来苏和清洁液浸泡清水清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗再洗涤涤含油脂的器皿：单独灭菌含油脂的器皿：单独灭菌玻璃器皿灭菌前的准备玻璃器皿灭菌前的准备玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。包裹和加塞后才能进行灭菌处理。培养基的种类培养基的种类（按用途分类按用途分类）基础培养基基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通：培养营养要求不高的细菌，如普通平板平板营养培养基营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，：

3、能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板如血平板鉴别培养基鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（菌，如克氏双糖培养基（KIA）选择培养基选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如的培养目的菌，如SS平板平板增菌培养基增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。较少的标本，如葡萄糖肉汤。厌氧培养基厌氧培养基：用于培养厌氧菌：用于培养厌氧菌培养基的种类培养基的种类（按物理性状分类按物理性状分类）液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和液体培养基：

4、不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。接种纯种细菌。半固体培养基：含半固体培养基：含0.30.5琼脂，用琼脂，用于观察细菌的动力。于观察细菌的动力。固体培养基：含固体培养基：含22.5琼脂，多用于琼脂，多用于细菌的分离培养。细菌的分离培养。培养基制备的一般程序培养基制备的一般程序调配调配溶化溶化矫正矫正pH过滤澄清过滤澄清分装分装灭菌灭菌检定检定培养基灭菌培养基灭菌 基础培养基：基础培养基：121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌15分钟分钟 含糖培养基：含糖培养基：113 灭菌灭菌15分钟分钟 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天天3次次 不耐高温的液体成分：滤过除菌不耐高温的液体成

5、分：滤过除菌保存pH矫正矫正水水培养基培养基培养基培养基比色管比色管 酚红酚红指示剂指示剂目目 视视 培养基蒸馏水pH矫正矫正过酸相同过碱标准比色管待测管 培养基蒸馏水标准比色管待测管 培养基蒸馏水标准比色管待测管细菌的接种与培养细菌的接种与培养无菌技术无菌技术细菌检验的操作需在无菌室或超净工作细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。台内进行。无菌室、超净工作台使用前后需进行消无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。毒。细菌检验使用的物品使用前后需严格灭细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌菌标本的采集标本的采集无菌试管、烧瓶的使用无菌试管、烧瓶的使用细菌接种法细菌接种法平板划线接种法平板划线

6、接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本液体培养基接种法液体培养基接种法穿刺接种法穿刺接种法:用于观察细菌动力用于观察细菌动力斜面接种法斜面接种法 倾注培养法倾注培养法:用于细菌计数用于细菌计数分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环细菌培养法细菌培养法一般培

7、养（需氧培养）：一般培养（需氧培养）：培养温度：培养温度：35（采用恒温培养箱）（采用恒温培养箱）培养时间：培养时间：1824h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等细菌在细菌在固体固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象菌落菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透菌落特征：大小、形状、

8、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性明度、湿润度、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。细菌在细菌在液体液体培养基中的生长现象培养基中的生长现象混浊混浊沉淀：多见于链状排列的细菌沉淀：多见于链状排列的细菌菌膜：多见于厌氧菌菌膜：多见于厌氧菌细菌在细菌在半固体半固体培养基中的生长现象培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只

9、沿穿刺线生长，穿刺线无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。边缘清晰。菌菌 落落细菌在液体培养基中的生长现象细菌在液体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象有动力有动力 现象现象无动力无动力 现象现象糖醇类代谢试验糖醇类代谢试验糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验甲基红试验V-P试验试验葡萄糖氧化发酵试验（葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验）试验）七叶苷水解试验七叶苷水解试验半乳糖苷渗透酶试验半乳糖苷渗透酶试验糖发酵试验糖发酵试验原理原理 多糖多糖单糖单糖丙酮酸丙酮酸酸性产物酸性产物(或产酸产气或产酸产气)pH 指示剂呈酸指示剂呈酸性变色性变色(若产气者有气泡

10、出现若产气者有气泡出现)培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微培养基：糖发酵管、半固体发酵管、微量发酵管量发酵管试剂：酚红、溴甲酚紫等试剂：酚红、溴甲酚紫等结果结果:培养基呈酸性变色培养基呈酸性变色应用：观察细菌对糖度的应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定用于肠道杆菌的鉴定甲基红试验甲基红试验原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基生成大量混合酸，使培养基pH维持在维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验反应。此为甲基红试验阳性。阳性。培养基：葡萄糖

11、蛋白胨水培养基：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红试剂试剂：甲基红试剂结果：加入试剂后，培养基呈现结果：加入试剂后，培养基呈现红色红色：+培养基不变色：培养基不变色：应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌伏普试验（伏普试验（V-P试验）试验）原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化胨

12、中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。合物。培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖蛋白胨水结果：加入试剂后，培养基呈现结果：加入试剂后，培养基呈现红色红色：+培养基不变色：培养基不变色：应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基红试剂甲基红试剂培养基培养基变红变红甲基红试验甲基红试验葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰V-P试剂培养基变红VP试验脱酸葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径葡萄糖丙酮酸

13、大量混合酸pH降至4.4以下甲基红试剂培养基变红乙酰甲基甲醇二乙酰V-P试剂培养基变红脱酸蛋白质类代谢试验蛋白质类代谢试验靛基质试验靛基质试验硫化氢试验硫化氢试验苯丙氨酸脱氨试验苯丙氨酸脱氨试验尿素酶试验尿素酶试验靛基质试验靛基质试验原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的原理：细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。培养基：蛋白胨水培养基：蛋白胨水试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）结果：加入试剂

14、后，培养基出现红色液面：结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+培养基液面为黄色：培养基液面为黄色：应用：用于肠道杆菌的鉴定应用：用于肠道杆菌的鉴定靛基质试验原理靛基质试验原理色氨酸酶色氨酸酶色氨酸色氨酸 靛基质靛基质（吲哚）（吲哚）玫瑰靛基质玫瑰靛基质（玫瑰吲哚）（玫瑰吲哚）对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛硫化氢试验硫化氢试验原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色络合物。或铅盐结合生成黑色络合物。培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基结果：

15、培养基结果：培养基 变黑变黑 为阳性，不变黑为阴为阳性，不变黑为阴性性应用：常用于肠道杆菌的鉴定应用：常用于肠道杆菌的鉴定苯丙氨酸脱氨实验苯丙氨酸脱氨实验原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯可使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿丙酮酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合物。色化合物。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基：苯丙氨酸琼脂试剂：试剂：10三氯化铁三氯化铁结果：加入试剂后培养基呈现结果：加入试剂后培养基呈现绿色绿色为阳为阳性性应用：多用于肠道杆菌的鉴定应用：多用于肠道杆菌的鉴定苯丙氨酸脱氨试验原理苯丙氨

16、酸脱氨试验原理苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸脱氨酶苯丙酮酸苯丙酮酸10三氯化铁三氯化铁绿色化合物绿色化合物尿素酶试验尿素酶试验原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。，氨使培养基呈碱性变色。培养基：尿素培养基培养基：尿素培养基试剂：酚红指示剂试剂：酚红指示剂结果：培养基变红：结果：培养基变红：+培养基不变色培养基不变色应用：肠杆菌科属间鉴定应用：肠杆菌科属间鉴定尿素酶试验原理尿素酶试验原理尿素尿素尿素酶尿素酶氨氨+CO2培养基培养基pH升高升高酚红呈碱性变色酚红呈碱性变色枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌

17、能力利用培养基中的枸橼酸盐原理：某些细菌能力利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯作为唯一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是酸盐和分解铵盐生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。指示剂呈碱性反应。培养基：枸盐酸盐培养基培养基：枸盐酸盐培养基试剂：溴麝香草酚蓝（试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色）以上呈蓝色）结果：培养基变蓝：结果：培养基变蓝：+培养基不变色：培养基不变色：应用：肠杆菌科属间鉴别应用：肠杆菌科属

18、间鉴别枸橼酸盐利用试验原理枸橼酸盐利用试验原理枸橼酸盐铵盐碳酸盐氨培养基pH下降溴麝香草酚蓝 呈碱性变色培养基变蓝培养基糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验甲基红试验靛基质试验靛基质试验血清学试验血清学试验血清学鉴定：血清学鉴定：用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原抗原血清学诊断：血清学诊断：用已知抗原检测血清中的特异性抗体用已知抗原检测血清中的特异性抗体血清学鉴定血清学鉴定试剂（诊断血清）试剂（诊断血清）：含抗体：含抗体 检测对象：特异性抗原检测对象：特异性抗原方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿胀试验胀试验 伤寒杆菌诊断血清（含抗伤寒杆菌抗体）+待检测细菌细菌凝集玻片凝集试验：阳性报告：检出伤寒杆菌血清学诊断血清学诊断试剂：含已知抗原试剂：含已知抗原应用：检测待检者血清中有无相应的抗应用：检测待检者血清中有无相应的抗体以及抗体的效价体以及抗体的效价