生物基因工程的基本操作程序新人教选修副本.pptx

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1、原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构(补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子第1页/共36页真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点

2、结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第2页/共36页基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4

3、、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第3页/共36页 目前被较广泛提取目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。因、植物抗病基因等。一、目的基因的获取一、目的基因的获取目的基因目的基因供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA限制酶剪去限制酶剪去多余部分多余部分限制酶限制酶1.1.目的基因主要是指目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因第4页/共36页2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）

4、从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成第5页/共36页1.概念：基因文库 （gene library）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)第6页/共36页基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.第7页/共36页基因组文库与部分基因文库的关系第8页/共36页提取某

5、种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库2 2基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一（1 1）直接分离法）直接分离法(鸟枪法鸟枪法)第9页/共36页某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶第10页/共36页第11页/共36页3.如何从基因文库中

6、得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因的翻译产物蛋白质 等特性。第12页/共36页4.4.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过以通过PCRPCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNADNA中，直接获中，直接获得，也可以

7、通过反转录，用得，也可以通过反转录，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中获得，中获得，不一定要构建基因文库。不一定要构建基因文库。但如果但如果所需要的目的基因的序列完全不知所需要的目的基因的序列完全不知，或，或只只知道目的基因序列的一段知道目的基因序列的一段，或，或想从一种生物体内获得想从一种生物体内获得许多基因许多基因，或者，或者想知道这种生物与另一种生物之间有想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同多少基因不同，或者，或者想知道一种生物在个体发育的不想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同同阶段表达的基因有什么不同，或者，或者想得到一种生物想得到一种生物的全基因组

8、序列的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。，往往就需要构建基因文库。第13页/共36页2.2.利用PCRPCR技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。第14页/共36页PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增，即即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）指数指数2 2n n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子第15页/共36页n 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DN

9、A退火：冷却至5560引物与部分模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸第16页/共36页2 2、具体过程、具体过程第17页/共36页v3.人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成第18页/共36页二二二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心核心核心质粒质粒DNADNA分子分子一个一个

10、切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶目的基因与运载体的结合过程，目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的实际上是不同来源的基因重组的过程。过程。第19页/共36页目的：目的：组成：组成：1、使目的基因在、使目的基因在受体细胞受体细胞中稳定存在，中稳定存在，且可以遗传给下一代，且可以遗传给下一代，2、使目的基因能够、使目的基因能够表达表达和和发挥作用发挥作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终

11、止子+标记基因标记基因+复制原点复制原点第20页/共36页启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来

12、胞筛选出来第21页/共36页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第22页/共36页1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农

13、杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第23页/共36页过程：第24页/共36页（2）基因枪法（3）花粉管通道法第25页/共36页2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物第26页/共36页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用

14、Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子第27页/共36页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功第28页/共36页（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因 (关键步骤)首先取出转基因生物的基因组DNA用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNADNA分子杂交（2）过程:第29页/共36页知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双

15、链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。第30页/共36页归纳步骤第31页/共36页（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法:抗原抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现

16、杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第32页/共36页归纳步骤第33页/共36页(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交第34页/共36页归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因u从基因文库u利用PCRPCRu化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：第35页/共36页感谢您的观看！第36页/共36页