生物化学实验技术常用分离技术.pptx

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1、 1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、破坏溶质周围形成的水化层，从而降低溶质溶解度；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂则仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。第1页/共25页4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5 5、选择性沉

2、淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。第2页/共25页 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂：1盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化 2有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。3等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。4非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。5生成盐复合物沉淀 用于

3、多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。6热变性及酸碱变性沉淀法 用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。第3页/共25页第一节 盐析法 所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。盐析法分为两类，第一类叫KsKs分段盐析法，在一定PHPH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PHPH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶.第4页/共25页盐的选择盐析条件的确定盐析公式log

4、S=-KsMKs-盐析常数M-浓度S-蛋白质溶解度第5页/共25页一影响盐析的若干因素 1蛋白质浓度2离子强度和类型 3PH值 4温度 第6页/共25页 1蛋白质浓度高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。第7页/共25页2离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时

5、候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾硫酸钠硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁。第8页/共25页3PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶

6、液PH值，以达到最好的盐析效果。第9页/共25页4温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4进行。第10页/共25页二硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H H2 2S S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H H2 2S S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100100烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0PH=5.0左右），使用前也

7、需要用氨水或硫酸调节至所需PHPH。第11页/共25页硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。第12页/共25页使用硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑

8、每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。第13页/共25页第二节 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-2-甲基-2,4-2,4戊二醇

9、等。第14页/共25页有机溶剂沉淀法优缺点:1 1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3 3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。第15页/共25页影响有机溶剂的沉淀效果因素 1）温度 低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH 与盐析法中的作用基本相同；3）金属离子 一些多价阳离子如Zn 2+和Ca 2+在一定PH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或

10、有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。4）离子强度 盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宜。第16页/共25页 第三节 其他沉淀法 一等电点沉淀法 二生成盐复合物沉淀法 三 选择性变性沉淀 四非离子多聚物沉淀法 第17页/共25页一等电点沉淀法 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PHPH值

11、。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。第18页/共25页二生成盐复合物沉淀法 1金属复合盐法 许多有机物质包括蛋白在内，在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制，可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类，如铜锌镉；亲羧酸含氮化合物类，如钙镁铅；亲硫氢基化合物类，如汞银铅。蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感，调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂），即可沉淀多种蛋白。第19页/共25页2 有机盐法含氮有机酸如苦味酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。但此法常发生不可逆的沉淀反应

12、，故用于制备蛋白质时，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。3无机复合盐法如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。总结：以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成 硫化物而除去，若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。值得注意的是此类方法常使蛋白质发生不可逆沉淀，应用时必须谨慎。第20页/共25页三 选择性变性沉淀 其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。此方法可分为：1）利用表面活性剂(SDS)或有机溶剂引起变性；

13、2）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。第21页/共25页四非离子多聚物沉淀法 非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。这类非离子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等，其中应用最多的是聚乙二醇。第22页/共25页用非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有两种方法：1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度、PH值和温度等影响，从而扩大分离效果。2）选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。第23页/共25页非离子多聚物沉淀法的应用 主要在细菌和病毒、核酸和蛋白质三个方面。如可以葡聚糖和聚乙二醇为两相系统分离单链DNADNA、双链DNADNA和多种RNARNA制剂；在2020世纪六十年代，聚乙二醇开始用于蛋白质纯化，其分子量多在2000-60002000-6000之间变化，多数认为PEG6000PEG6000沉淀蛋白较好。第24页/共25页感谢您的观看！第25页/共25页