第10章分子生物学课件.pptx

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1、第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology第1页/共53页核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理

2、第2页/共53页复性复性RNADNA第3页/共53页（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术探针探针(probe)一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是是否否有同源的核酸分子存在。有同源的核酸分子存在。第4页/共53页二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southernblotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技

3、术印迹技术(Northernblotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第5页/共53页 其他其他斑点印迹斑点印迹(dotblotting)原位杂交原位杂交(insituhybridization)DNA点阵点阵(DNAarray)DNA芯片技术芯片技术(DNAchip)第6页/共53页三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较第7页/共53页分子杂交实验分子杂交实验目录第8页/共53页放放射射自自显显影影照照片片目录第9页/共53页D

4、NA点阵点阵目录第10页/共53页第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction第11页/共53页5 Primer15 Primer2Cycle2Cycle15 5 5 5 5 5 TemplateDNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理目录第12页/共53页Cycle35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目录第13页/共53页PCRPCR的基本工作原理是以拟扩增的是以拟扩增的DNA分子为模板分子为模板

5、,以一对分别与模板以一对分别与模板5末端和末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物末端相互补的寡核苷酸片段为引物,在在DNA聚合聚合酶的作用下酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成合成,重复这一过程重复这一过程,即可使目的即可使目的DNA片段得到扩增片段得到扩增.第14页/共53页n模板模板DNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶ndNTPsnMg2+二、PCRPCR体系基本组成成分第15页/共53页三、PCR的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第16页/共53页（一）目的基因的克

6、隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途第17页/共53页三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术第18页/共53页实时PCRPCR技术原理目录第19页/共53页第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis第20页/共53页核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(sanger法法)第21页/共53页一、化学裂解法(Maxam-G

7、illbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列

8、。第22页/共53页二、DNA链末端合成终止法第23页/共53页目录第24页/共53页三、DNA自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧光信号，并依此确定荧

9、光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。第25页/共53页DNA自动测序结果举例目录第26页/共53页基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节第27页/共53页基因组基因组DNA文库文库 (genomicDNAlibrary)cDNA文库文库 (cDNAlibrary)基因文库基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。第28页/共53页基因组DNA文库目录第29页/共53页第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例第30页/共53页疾病相关基因的克隆与鉴定

10、疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节第31页/共53页克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)第32页/共

11、53页定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。得到部分纯化的遗传性疾病。第33页/共53页克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选针，筛选cDNA文库。文库。功能互补试验功能互补试验 (functionalcomplementationassay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病

12、基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。第34页/共53页（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基因分析、基因文库的筛选与基因克隆文库的筛选与基因克隆第35页/共53页（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的由于基因组作图的完成和

13、分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。预测出候选致病基因。第36页/共53页（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。据，鉴定出候选致病基因。第37页/共53页第第 六六 节节遗传修饰动物模型的建遗传修饰动物模型的建立及应用立及应用The Establishment and Applica

14、tion of Heredity-Modified Animal Model 第38页/共53页转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenicanimal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术第39页/共53页目录第40页/共53页核转移技术即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个

15、体体的的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术第41页/共53页基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向(genetargeting)灭活，灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术第42页/共53页四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-functionmutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型第43页/共53页第第 七七 节节 生生 物

16、物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology第44页/共53页DNA芯片芯片(DNAchip)cDNA芯片芯片(cDNAchip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片基因芯片(genechip)第45页/共53页目录第46页/共53页是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的

17、的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)第47页/共53页第第 八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 Research Technology of Interaction of Protein第48页/共53页蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制的复

18、制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质之间相互作用研究的重要性第49页/共53页酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术第50页/共53页一、酵母双杂交技术的基本原理目录第51页/共53页二、酵母双杂交系统的应用（一）分析已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用第52页/共53页感谢您的观看！第53页/共53页