第二代DNA测序技术.pptx

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1、第二代第二代DNADNA测序技术简介测序技术简介第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术核心思想：边合成边测序特点：读长短、通量高，成本低、测序快第1页/共16页 454 454技术技术Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台测序原理：焦磷酸测序法4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，4种酶混合物（DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶）和底物混合物（包括APS和荧光素）。第2页/共16页焦磷酸测序法原理及步骤

2、第一步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，发生以下反应第二步：上一步中生成的PP i和APS在硫酸化酶的催化下生成ATP，ATP可使荧光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化，同时产生可见光，光信号强弱与ATP含量成正比，又n（ATP）=n（PP i）=n（加入的dNTP），因此可根据光信号强弱推知加入的dNTP的个数第三步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的作用下降解第四步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息第3页/共16页454454测序流程测序流程（1）

3、DNA文库制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，末端修复后在片段两端加上不同的接头，变性处理回收单链DNA。（2）体外DNA扩增：454系统采用的是乳化PCR的方法进行扩增。第4页/共16页（3）富集固定：将含有DNA片段的磁珠富集起来，并将这些磁珠置于一种PTP平板中的特制小孔中，每个孔只能容纳一个磁珠。（4）测序：采用焦磷酸测序法，每个含有磁珠的小孔都可以测出其中一个片段的序列。第5页/共16页 IlluminaIllumina测序测序Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器测序原理：类似Sanger测序法，dNTP的3-OH

4、被化学方法所保护，并带有碱基特异荧光标记，因而每次只能添加一个dNTP，放出一个荧光信号。第6页/共16页 IlluminaIllumina测序流程测序流程（1）DNA文库制备：把待测的DNA样本打断成小片段，两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库（2）体外DNA扩增：IlluminaIllumina测序系统采用的是测序系统采用的是桥式桥式PCRPCR扩增扩增第7页/共16页（3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循环即可测出该片段序列。第8页/共16页 S

5、olidSolidSolidSolid技术技术技术技术Solid测序技术是第二代基因分析技术中准确度最高的。测序原理：基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。第9页/共16页连接法测序原理连接法测序原理合成新链所用酶：DNA连接酶底物：8碱基单链荧光探针混合物3-XXnnnzzz-5，根据XX的不同在探针的5末端分别标记了4种颜色的荧光染料 当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会 发出代表第1，2位碱基的荧光信号第10页/共16页连接法测序步骤连接法测序步骤 （1 1）第一次连接反应第一次连接反应由连接引物由连接引物“n”“n”介导，掺入一种介导，掺入一种8 8碱基荧光探

6、针后碱基荧光探针后SOLiDSOLiD测序仪记录下探针第测序仪记录下探针第1 1、2 2位编码区颜色信息位编码区颜色信息 （2 2）化学处理除去）化学处理除去6868位碱基及位碱基及55末端荧光基团，暴露探针第末端荧光基团，暴露探针第5 5位碱基位碱基55磷酸，为下一次连接反应作准备磷酸，为下一次连接反应作准备 （3 3）第二次连接反应得到模板上第）第二次连接反应得到模板上第6 6、7 7位碱基序列的颜色信息，而第三位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第次连接反应得到的是第1111、1212位碱基序列的颜色信息位碱基序列的颜色信息 （4 4）测到末尾后，将新合成的链变性，洗脱。引物重

7、置，开始第二轮的）测到末尾后，将新合成的链变性，洗脱。引物重置，开始第二轮的测序测序第11页/共16页（1 1）第一次连接引物）第一次连接引物n-1n-1比第一轮错开一位，所以此次得到比第一轮错开一位，所以此次得到0 0，1 1位碱基位碱基对的颜色信息对的颜色信息（2 2）化学处理后，第二次连接反应得到的是）化学处理后，第二次连接反应得到的是5 5，6 6位碱基对位碱基对的颜色信息，的颜色信息，第三次是第三次是1010，1111位碱基对的颜色信息位碱基对的颜色信息 这样经过这样经过5 5轮测序后，可得到由颜色编码组成的轮测序后，可得到由颜色编码组成的SOLiDSOLiD原始序列，只要原始序列，

8、只要知道所测知道所测DNADNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiDSOLiD原始颜原始颜色序列色序列“解码解码”成碱基序列成碱基序列第12页/共16页Solid技术测序流程（1）DNA文库构建：片段打断，并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。（2）体外扩增：乳化PCR，磁珠直径约1um，在扩增的同时对扩增产物的3端进行修饰（为后面测序做准备）（3）磁珠富集转至测序玻片（4）连接法测序第13页/共16页三种平台的技术差异454技术IlliminaIllimina测序测序Solid技术体外PCR扩增方法磁珠乳化PCR（磁珠直径约28um）桥式PCR磁珠乳化PCR（磁珠直径约1um）测序原理焦磷酸测序法可逆终止物测序（类似Sanger测序法）连接法测序读长差异400-600bp100-150bp50-75bp第14页/共16页谢谢倾听！谢谢倾听！第15页/共16页感谢您的观看！第16页/共16页