第十一章荧光分析法.pptx

《第十一章荧光分析法.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十一章荧光分析法.pptx（37页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、2023/2/17荧光分析法：是基于被测物质的荧光谱线位置及其强度进行的分析方法（属于发射光谱法）。应用对象：一般是能产生强荧光的分子或某些特定离子本章重点：（1）分子荧光产生的过程（2）荧光与分子结构关系（3）分子荧光定量方法 第1页/共37页2023/2/17一、分子荧光与磷光的产生过程1.1.分子电子能级与激发过程分子能级比原子能级复杂；在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级。多数分子常温时处在基态最低振动能级，当吸收能量便可发生能级间跃迁。为便于说明电子跃迁过程，必须确定电子能级的多重性用符号M M表示。M=2S+1M=2S+1，S S轨道总自旋量子数 第2页/共37页2023/

2、2/17S S为电子自旋量子数的代数和(要么为0 0要么为1)1)；S=0S=0时M=1M=1，此时电子所处的能态为单重态用符号S S表示。S=1S=1时M=3M=3，此时电子所处的能态为三重态用符号T表示。平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态用S S0 0表示；第3页/共37页2023/2/17电子吸收一定能量由基态(S0)向激发态发生跃迁若电子方向不改变产生激发单重态(用S1、S2表示)若电子方向改变产生激发三重态(用T1、T2表示)激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第4页/共37页20

3、23/2/172.2.激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转移振动驰预系间跨越无辐射跃迁激发态停留时间越短、返回速度越快的途径，发生几率最大，发光强度相对也越最大；荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；第5页/共37页2023/2/17S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫第6页/共37页2023/2/17（1 1）振动弛豫（Vibrationa

4、l Relaxation,VRVibrational Relaxation,VR）在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量以热的形式传递给周围的溶剂分子，电子则从高振动能层返回到低的振动能级的过程，称为振动弛豫。该过程在同一电子能级内进行。（2 2）内转换（Internal ConversionInternal Conversion，ICIC）对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁的过程，如S S2 2-S-S1 1；T T2 2-T-T1 1。该过程在同一类电

5、子能级相邻的激发态间进行。第7页/共37页2023/2/17（3）外转换（External Conversion，EC）受激分子与溶剂分子或其它分子相互碰撞而失去能量，从而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。该过程发生在S1S0，T1S0（4）系间跨跃（Intersystem Conversion，ISC）系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。发生在不同多重态之间第8页/共37页

6、2023/2/17（5 5）荧光发射电子从第一激发单重态最低振动能级（时间1010-9-9-10-10-7-7s s）以辐射形式跃迁到基态各振动能级所产生的光子辐射称为荧光或荧光发射。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发光能量低，即荧光波长总是大于激发波长。（6 6）磷光发射电子从第一激发三重态的最低振动能级以辐射形式跃迁到基态的各个振动能级所产生的光子辐射称为磷光或磷光发射。由于三重态振动能级比单重态的低，即磷光波长总是大于荧光波长。第9页/共37页2023/2/17二、荧光的激发光谱和发射光谱荧光：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光的激发光谱（曲线）固定发射波长(选最大

7、发射波长),),通过激发单色器扫描，以不同激发光照射荧光物质，记录荧光强度对激发光波长的关系曲线（图中曲线I I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，发射的荧光强度最大。第10页/共37页2023/2/172.2.荧光光谱(发射光光谱)固定激发光波长和强度(选最大激发波长),),通过发射单色器扫描，记录荧光强度与发射光波长关系的曲线(图中曲线II)。任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。第11页/共37页2023/2/173.3.激发光谱与发射光谱的关系（1 1）StokesS

8、tokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。（2）发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长能量(如能级图 2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2)。（3）镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。第12页/共37页2023/2/17200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱第13页/共37页2023/2/17二、荧光产生与分子结构关系1、产生并可观察到荧光的条件：（1

9、）分子必须具有强的紫外可见吸收结构（内因）；（2）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光光量子数。即量子效率 足够大：可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常kF 由分子结构决定（内因），而其它参数则由化学环境和结构共同决定。一般物质的荧光量子效率为01第14页/共37页2023/2/172.2.有机化合物分子结构与荧光关系（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似

10、结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：给电子基如NH2、OH、OCH3使荧光增强，波长长移；吸电子基如NO2、F、Cl使荧光减弱或熄灭。第15页/共37页2023/2/17第16页/共37页2023/2/173.3.影响荧光强度外部因素（1）温度：对荧光强度有显著影响。随温度升高荧光强度降低。因为内、外转换增加、粘度或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度（2）溶剂：溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变 *及n*跃迁的能量）；另外与溶剂作用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。（3）酸度：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强

11、度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。第17页/共37页2023/2/17第十一 章 荧光分析法一、荧光强度与浓度关系二、定量方法第二节 荧光定量分析方法第18页/共37页2023/2/17一、荧光强度与物质浓度关系 荧光强度 F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：F=Ia 由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)F=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时（l c 0.050.05），将括号项近似处理后：F=2.3 I0 l c =KC K荧光系数（与物质性质、激发波长、发射波长、溶剂、温度有关）二、定量方法1

12、1、校正曲线法：用已知量的标准物质经过和试样一样的处理后，配制成系列标准溶液，在一定的仪器条件下测定这些第19页/共37页2023/2/17Fci溶液的荧光强度，以标准溶液的浓度为横坐标，对应的荧光强度为纵坐标绘制出标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上查出试样的浓度。在测定工作曲线时，常采用系列中某一标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调至0，将该标准溶液的荧光强度读数调至100或50，然后测定系列中其他标准溶液的荧光强度。所以荧光强度实为相对值。第20页/共37页2023/2/17注意事项（1）为了使不同时间所测得的标准曲线先后一致，每次绘制工作曲线时最好采用同

13、一种稳定的荧光物质（硫酸奎宁溶液）来校正仪器的读数。（2）另外，在测量时标准溶液和试样溶液的荧光强度，都应扣除空白溶液的荧光强度。理想的或者说真实的空白溶液，原则上应当具有与未知试样溶液中除分析物质以外的同样组成，可是对于实际遇到的复杂分析体系，很少有可能获得这种真实的空白溶液，在实验中通常只能采用近似于真实空白溶液。最简单的是溶剂空白。第21页/共37页2023/2/17它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质沾污的荧光化合物的直接测定。（3）采用试剂空白则更好一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂质所引起的吸收和发光，

14、可用于间接测定法。（4）但这两种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于真实的空白溶液。如测VB2时用连二亚硫酸钠Na2S2O4第22页/共37页2023/2/172 2、比较法：如果已知某测定物质的荧光校准曲线浓度的线性范围，取已知量的荧光物质配成一标准溶液，测定其荧光强度。然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度的比值求得试样中荧光物质的含量。3 3、联立方程法（多组分）：依据就是荧光强度具有加和性（1 1）当混合物中各组分的荧光峰相距颇远、彼此干

15、扰很小时，可分别在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度，然后按单一组分定量方法进行定量。（2 2）若混合物中各组分的荧光峰相近，彼此严重重叠，但第23页/共37页2023/2/17它们激发光谱确有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定，然后按单一组分进行定量。（3 3）选择两波长时仍无法达到混合物各组分的分别测定，这时就要进行联和测定，解联立方程而求得。例如：硫胺荧的激发峰在385nm385nm，荧光峰在435nm435nm，吡啶硫胺荧激发峰在410nm410nm，荧光峰在480nm480nm，采用385nm或410nm为激发峰，测定混合物的试样溶液在435nm和480nm的荧光强度F，

16、然后由所测出的混合物的荧光强度及事先测定的硫胺荧和吡啶硫胺荧在上述的激发波长和发射波长下的相应荧光系数而列出下列方程。第24页/共37页2023/2/17假设选择385nm作为激发波长例题：利用连二亚硫酸钠可熄灭核黄色发出的荧光来测定奶粉中的维生素含量。精确称取0.5000g奶粉，加pH=4.6的HAcNaAc缓冲液沉淀蛋白质，移入50ml溶量瓶中，加水至刻线，摇匀，过滤，取滤液测得荧光强度Fx=28.5，取出比色皿加入少量的连二亚硫酸钠，迅速摇匀使维生素B2第25页/共37页2023/2/17荧光熄灭，立即再测荧光强度为F Fo o=6.20=6.20。在另一比色皿中加入24ml24ml被测

17、维生素B B2 2溶液后再加入浓度为0.25000.2500g/mlg/ml维生素B B2 2标准溶液1ml1ml，测得荧光强度为F=48.6F=48.6。计算奶粉中维生素B B2 2的含量 解：选用比较法，设含量为C CX X（g/mlg/ml）28.5-6.20=K 28.5-6.20=K CX 48.6-6.20=K(Cx+CC)=K(Cx+10.2500/25)Cx=0.0111 g/ml，则奶粉中维生素B2含量为 0.011150/0.5000=0.2775 g/g第26页/共37页2023/2/17三、荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约6

18、060多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析（见表）第27页/共37页2023/2/17第28页/共37页2023/2/17第29页/共37页2023/2/17第十一 章 荧光分析法一、流程图二、主要组成部件三、应用实例第三节 荧光分光光度计第30页/共37页2023/2/17光光源源第一第一单色器单色器第二第二单色器单色器激激发发荧光荧光样品池样品池检测系统检测系统一、荧光光度计示意

19、图第31页/共37页2023/2/17仪器光路图第32页/共37页2023/2/17可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图第33页/共37页2023/2/172、分光系统(双单色器)第一单色器作用：选择激发波长第二单色器作用：分离出荧光发射波长二、主要部件1、光源氙弧灯：250-800 nm连续光谱高压汞灯：线光谱（最好）3、样品池：石英材料做成的四面透光比色皿，1cm4、检测器：光电倍增管第34页/共37页2023/2/17三、应用实例荧光光度法测量维生素B2（标准曲线法）维生素B2也称核黄素，在430480nm蓝光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在525nm。在pH为67溶液中它的荧光强度最大，而在pH=11溶液中荧光消失。（1）先确定激发光谱和发射光谱用1醋酸溶液溶解核黄素标准品并用1醋酸稀释定容，制得一定浓度的标准溶液，将标准溶液装入比色皿后放入仪器的池架上，关好样品室盖，进行激发光谱和发射光谱扫描。（2）绘制标准曲线第35页/共37页2023/2/17配制系列标准溶液，在固定激发波长和发射波长条件下测量荧光强度。（3）待测试样的处理和测量溶解维生素B2片剂，摇匀静止后吸取上层清液配制溶液，在相同实验条件下进行测量荧光强度，由标准曲线查找浓度或含量。第36页/共37页2023/2/17感谢您的观看！第37页/共37页