细胞原代培养实验.pptx

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1、掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握组织细胞的消化与分散。掌握组织细胞的消化与分散。熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。熟悉小鼠解剖操作技术。熟悉小鼠解剖操作技术。实验目的和要求：实验目的和要求：第1页/共9页 选择大约一半足孕时间的胚胎，选择大约一半足孕时间的胚胎，10101313天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。每组小鼠胚胎每组小鼠胚胎2-52-5个个动物的选择：动物的选择：第2页/共9页实验材料：实验材料：每组的超净台中有以下物品：每组

2、的超净台中有以下物品：1.50ml 1.50ml 配制好的配制好的RPMI1640RPMI1640（或（或DMEMDMEM）培养液）培养液1 1瓶；瓶；8ml8ml小牛血清（小牛血清（FCS)1FCS)1瓶；瓶；100ml 0.25%100ml 0.25%胰蛋胰蛋白酶白酶 1 1瓶；瓶；PBS(-)(PBS(-)(生理型磷酸盐缓冲液生理型磷酸盐缓冲液)1)1 瓶瓶2.100ml2.100ml灭菌烧杯灭菌烧杯2 2个；个；3 3、50ml50ml离心筒离心筒2 2个个4 4、灭菌培养皿、灭菌培养皿1 1个，细胞培养瓶个，细胞培养瓶1 1个个4 4、1ml 1ml，200l200l移液器各移液器各

3、1 1支；枪头盒支；枪头盒2 2个；无个；无菌玻璃搅拌棒菌玻璃搅拌棒1 1个个5 5、细胞计数板、细胞计数板1 1块；块；6 6、灭好菌的镊子、灭好菌的镊子1 1把，剪刀把，剪刀1 1把；把；7 7、酒精灯、酒精灯1 1台；台；第3页/共9页试验操作步骤：试验操作步骤：1)1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠)a a采用认可的方案处死啮齿动物。采用认可的方案处死啮齿动物。b b立即在无菌超净台内用立即在无菌超净台内用7070乙醇擦洗整个动物。乙醇擦洗整个动物。c c用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水

4、平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。用无菌镊子将皮肤扯向后腿。d d用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。胎的子宫，置于无菌的培养皿上。e e剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌菌PBS(-)PBS(-)的的100ml100ml烧杯中。烧杯中。f f漂洗胚胎，去掉漂洗胚胎，去掉PBS(-)PBS(-)。继续用。继续用PBS(-)PBS(-)漂洗胚胎漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。直至清洗液清亮为止。第4页/共9页2)2)将将2 25 5个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用个胚

5、胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用用PBSPBS漂洗。漂洗。3)3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 50ml 的的无菌离心筒中无菌离心筒中,加入加入40ml 0.2540ml 0.25的无菌胰蛋白的无菌胰蛋白酶酶,用搅拌棒轻轻搅动用搅拌棒轻轻搅动 。4)4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 C37 C培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动1515分钟。分钟。5)5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌悬浮细胞的液体

6、转移至一无菌50ml50ml的离心管中，的离心管中，该管内按照每该管内按照每10ml10ml上清加入上清加入l mll ml小牛血清的比例小牛血清的比例加入牛血清以灭活加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。6)6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤见前述步骤)于含有残留于含有残留未消化组织块的原来的未消化组织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤4 4和和5 5。试验操作步骤：试验操作步骤：第5页/共9页7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r1200rrainrain，5 5分钟，弃上分钟，弃上清。清。8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无

7、菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤7 7再次离再次离心。心。9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素如青霉素、链霉素)的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为再悬沉淀，并使终体积为20ml20ml。11)11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。

8、的细胞块。试验操作步骤：试验操作步骤：第6页/共9页12)12)为确定现有细胞浓度，加入为确定现有细胞浓度，加入0.2ml0.2ml细胞悬液于细胞悬液于1.8ml 11.8ml 1醋酸溶液中以裂解红细胞，醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。用血细胞计数器进行细胞计数。13)13)按每细胞瓶按每细胞瓶I x 10I x 106 6细胞的数量接种于细胞的数量接种于10ml10ml组织组织培养液中，在饱和湿度的培养液中，在饱和湿度的37C C037C C02 2培养箱中孵育直培养箱中孵育直至细胞铺满。至细胞铺满。14)14)隔天进行细胞观察。隔天进行细胞观察。试验操作步骤：试验操作步骤：第7页/共9页第8页/共9页2023/2/17感谢您的观看！第9页/共9页