色谱法概论学习.pptx

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1、1 要求要求 掌握各种色谱技术的基本原理掌握各种色谱技术的基本原理熟悉判断分离效率的指标熟悉判断分离效率的指标熟悉色谱术语熟悉色谱术语掌握定量分析计算方法掌握定量分析计算方法第1页/共87页2 第一节第一节 概概 述述一、色谱法的发展一、色谱法的发展 二、色谱法的分类二、色谱法的分类第2页/共87页3 一一.色谱法的发展色谱法的发展 1.定定 义义2.起源与发展起源与发展3.优优 点点4.缺缺 点点第3页/共87页4 1.定定 义义色谱法（色谱法（chromatography)分离分析混合物的一种有分离分析混合物的一种有效的物理和物理化学方法。效的物理和物理化学方法。第4页/共87页5 2.起

2、源与发展起源与发展 1906年年Tswett创立创立四十年代四十年代Martin发展方发展方法法五十年代五十年代Martin、synge、Van deemter建立理建立理论论六十年代六十年代Horvathc HPLC第5页/共87页6 色谱分离示意图色谱分离示意图第6页/共87页7 3.实实 质质：一种物理分离方法一种物理分离方法4.机机 理理：欲分离混合物在两相间发生分欲分离混合物在两相间发生分布布固定相：固定相：有巨大表面积的固定床有巨大表面积的固定床流动相：流动相：通过或沿着固定床渗滤通过或沿着固定床渗滤的流体的流体第7页/共87页8 色谱法的色谱法的原理原理主要是利用物质主要是利用物

3、质在流动相与固定相之间的分配在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。系数差异而实现分离。色谱法存在色谱法存在三要素三要素：待分离的：待分离的混合物、固定相和流动相。混合物、固定相和流动相。第8页/共87页95.优优 点：点：灵敏、选择性好、灵敏、选择性好、分析速度快、应用范围广分析速度快、应用范围广6.缺缺 点：点：定性能力差定性能力差第9页/共87页10（1）与光谱法比较）与光谱法比较色谱法与光谱法的主要区别色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备两种功能，而光谱法不具备分离功能。分离功能。第10页/共87页11（2）与其他分离方

4、法比较）与其他分离方法比较与其他分离方法，如蒸馏、结晶、与其他分离方法，如蒸馏、结晶、沉淀、萃取法相比，色谱法具有极沉淀、萃取法相比，色谱法具有极高的分离效率高的分离效率.不仅可使许多性质相近的混合物分不仅可使许多性质相近的混合物分离，还可使同分异构体获得分离离，还可使同分异构体获得分离.已成为各种实验室的常规手段，是已成为各种实验室的常规手段，是分析化学的重要分支。分析化学的重要分支。第11页/共87页12 二、色谱法的分类二、色谱法的分类 1.按两相所处状态分类按两相所处状态分类2.按分离过程机理分类按分离过程机理分类3.按操作形式分类按操作形式分类第12页/共87页13 1.按两相所处状

5、态分类按两相所处状态分类 气固色谱气固色谱(GSC)气相色谱气相色谱 流动相流动相 (GC)气液色谱气液色谱(GLC)液固色谱液固色谱(LSC)液相色谱液相色谱 (LC)液液色谱液液色谱(LLC)超临界流体色谱法超临界流体色谱法(SFC)第13页/共87页142.按分离过程机理分类按分离过程机理分类吸附色谱吸附色谱：吸附性能差异：吸附性能差异分配色谱分配色谱：流动相和固定相间的分：流动相和固定相间的分配系数（或溶解度）不同配系数（或溶解度）不同键合相色谱法键合相色谱法：吸附分配：吸附分配离子交换色谱离子交换色谱：离子交换能力不：离子交换能力不同同凝胶排阻色谱凝胶排阻色谱：分子尺寸大小不：分子尺

6、寸大小不同而阻滞作用不同同而阻滞作用不同第14页/共87页15 毛细管电泳法：以高压直流电场为驱动力，含有液体介质（电解质溶液）的毛细管为分离通道，利用样品中不同带电组分的电泳淌度的差别，而进行的一种分离分析方法。毛细管电色谱法：以在高压直流电场中所产生的电渗流为驱动力，毛细管色谱柱为分离通道，依据样品中不同组分的分配系数及电泳淌度的差别，而进行的一种分离分析方法。第15页/共87页163.按操作形式分类按操作形式分类 填充柱色谱法填充柱色谱法柱色谱法柱色谱法 毛细管柱色谱法毛细管柱色谱法 纸色谱法纸色谱法 PC平面色谱法平面色谱法 薄层色谱法薄层色谱法 TLC第16页/共87页174.4.按

7、使用目的分类按使用目的分类（1 1）分析用色谱）分析用色谱（2 2）制备用色谱仪）制备用色谱仪（3 3）流程色谱）流程色谱简化分类如图9-1 第17页/共87页18第二节第二节 色谱过程色谱过程 及常用术语及常用术语一、色谱过程一、色谱过程二、常用术语二、常用术语三、色谱流出曲线上的重要信息三、色谱流出曲线上的重要信息第18页/共87页19 一一.色谱过程色谱过程1.分配平衡分配平衡2.分配系数分配系数K 3.容量因子容量因子k4.保留值保留值R保留因子（比）保留因子（比）5.K、k、R的关系的关系第19页/共87页20 1.分配平衡分配平衡第20页/共87页21 2.2.分配系数K K 分配

8、系数：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即物理意义：溶质在互不相溶的两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比为常数第21页/共87页22第22页/共87页23色谱过程色谱过程是物质在相对运动着的两相间分配平是物质在相对运动着的两相间分配平衡的过程。衡的过程。若混合物中二个组分的分配系数不等，若混合物中二个组分的分配系数不等，则被流动相携带移动的速度不等，而则被流动相携带移动的速度不等，而被分离。被分离。分配系数不等是分离的前提。分配系数不等是分离的前提。第23页/共87页24 分配系数分配系数K与组分的性质、溶剂的极与组分的性质、溶剂的极性、温度等因素有关。在给

9、定条件性、温度等因素有关。在给定条件下，组分性质不同，下，组分性质不同，K也不同。也不同。K可适用于多种机理，不同的色谱机可适用于多种机理，不同的色谱机理中理中K的含义不同：的含义不同：在吸附色谱中，在吸附色谱中，K为为吸附平衡常数吸附平衡常数，在离子交换色谱中，在离子交换色谱中，K为为交换常数或交换常数或称选择系数称选择系数。第24页/共87页25 不论是离子交换过程、溶解过程、不论是离子交换过程、溶解过程、吸附过程，吸附过程，K值都决定于二相中组值都决定于二相中组分的相对粒子数。分的相对粒子数。如果如果K值大，则固定相中的粒子数值大，则固定相中的粒子数比流动相中的粒子数多。从总体平比流动相

10、中的粒子数多。从总体平均来看，这一组分的分子在固定相均来看，这一组分的分子在固定相中停留的时间更长。中停留的时间更长。第25页/共87页26 3.容量因子容量因子k 指在一定温度和压力下，组分在指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中物质的定相和流动相中物质的量的比量的比。又称又称分配比分配比，即，即 第26页/共87页27 称为相比率，是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。第27页/共87页284.保留因子保留因子(比比)R 保留值保留值定定 义义：样品在流动相中出现的样品在流动相中出现的几率几率，即在流动相中停留的时间分数，即在流动相

11、中停留的时间分数，用用R表示。表示。第28页/共87页29 第29页/共87页30 组分的移动速率组分的移动速率取决于分配系数取决于分配系数K数数K值相同，组分不能分离值相同，组分不能分离K值不同，组分在柱上移动速度不同值不同，组分在柱上移动速度不同色谱是色谱是不同迁移现象不同迁移现象的最终产物。的最终产物。第30页/共87页315.K、k、R三者关系三者关系假设色谱柱的柱长为假设色谱柱的柱长为L，则，则第31页/共87页32 二二.常用术语常用术语 1.流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰 2.基线基线 3.峰高（峰高（h）4.峰面积（峰面积（A）5.保留值保留值 6.选择因子选择因子 7.色谱

12、峰区域宽度色谱峰区域宽度第32页/共87页33 1.流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰色谱仪记录器记录的电信号色谱仪记录器记录的电信号信号强度对信号强度对t t作图所绘制的曲线作图所绘制的曲线流出曲线流出曲线曲线上突出的部分曲线上突出的部分色谱峰色谱峰第33页/共87页34色谱流出曲线上的重要信息：色谱流出曲线上的重要信息：l)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样样品品中中所所含组份的最少个数。含组份的最少个数。2)根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值(或或位位置置），可可以以进行定性分析。进行定性分析。3)根根据据色色谱谱峰峰下下的的面面积积或或峰峰高高，可可以以进进行定量分析

13、。行定量分析。4)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度，是是评评价色谱柱分离效能的依据。价色谱柱分离效能的依据。5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。和流动相选择是否合适的依据。6)调整保留时间和体积反映了组分与固调整保留时间和体积反映了组分与固定相以及流动相之间的相互作用。定相以及流动相之间的相互作用。第34页/共87页352.基线：基线：色谱柱中仅有流动相色谱柱中仅有流动相通过时，检测器响应的信号记录通过时，检测器响应的信号记录,通常与横轴平行。通常与横轴平行。基线反映检测器的噪音随时间的变化，稳定的基线应当是基线反

14、映检测器的噪音随时间的变化，稳定的基线应当是一条直线。一条直线。第35页/共87页363.峰高峰高(h)：色谱峰顶点与基线色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。之间的垂直距离。4.峰面积峰面积(A)：色谱峰所包围的面积。色谱峰所包围的面积。定定量量依依据据第36页/共87页37 5.保留值保留值组分在柱内滞留状况的一个指标组分在柱内滞留状况的一个指标1)死时间死时间 tM2)保留时间保留时间tR 3)调整保留时间调整保留时间tR4)死体积死体积VM5)保留体积保留体积 VR6)调整保留体积调整保留体积VR7)相对保留值相对保留值2.1第37页/共87页38 第38页/共87页39 1)死时间死时间

15、tM 不被固定相吸附或溶解的物质进不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为大值所需的时间称为死时间死时间。第39页/共87页40 2)保留时间保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大试样从进样开始到柱后出现峰极大点点时所经历的时间，称为时所经历的时间，称为保留时间保留时间。如图如图OB它相应于样品到达柱末端的它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。检测器所需的时间。第40页/共87页413)调整保留时间调整保留时间tR某组份的保留时间扣除死时间后称为该某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的组份的调整保留时间调整保留时间，即，即

16、 tR=tR-tM由于组份在色谱柱中的保留时间由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时实际上是组份在固定相中停留的总时间。间。第41页/共87页424)死体积死体积VM 指指惰惰性性组组分分从从进进样样开开始始到到柱柱后后出出现现浓浓度度极大点时所通过的流动相体积。极大点时所通过的流动相体积。指指从从进进样样器器到到柱柱后后出出口口未未被被固固定定相相所所占占据的一切空间。据的一切空间。死体积可由死时间与流动相流速死体积可由

17、死时间与流动相流速Fc（mLmin）计算：）计算：VM=tMFc第42页/共87页435)保留体积保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。过的流动相体积。VR=tRFc第43页/共87页446)调整保留体积调整保留体积VR某组份的保留体积扣除死体积，某组份的保留体积扣除死体积，称该组份的称该组份的调整保留体积调整保留体积。VR=VR-VM第44页/共87页457)相对保留值相对保留值i.s某组份的调整保留值与另某组份的调整保留值与另一基准物的调整保留值之一基准物的调整保留值之比比 注意注意:相对保留值不是两

18、个组份保留时相对保留值不是两个组份保留时间或保留体积之比间或保留体积之比 ；而是；而是调整保留时调整保留时间或调整保留体积之比间或调整保留体积之比。第45页/共87页466.选择因子选择因子越大，两组分分得越开，色谱柱对越大，两组分分得越开，色谱柱对组分的选择性越高。组分的选择性越高。=1，两组分完全重叠，不能分离。两组分完全重叠，不能分离。第46页/共87页477.色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度描述色谱流出曲线的另一个描述色谱流出曲线的另一个重要参数重要参数,用用来来量度色谱分离的效率，反映柱效的高低。量度色谱分离的效率，反映柱效的高低。第47页/共87页48表示区域宽度的三种形式：表示区域宽

19、度的三种形式：1)标准差标准差 0.607 倍峰高处色谱峰宽的一半倍峰高处色谱峰宽的一半 2)半峰宽半峰宽W1/2 峰高一半处对应的峰宽峰高一半处对应的峰宽 3)基线宽度基线宽度W 峰两侧拐点上切线在基线上的截距峰两侧拐点上切线在基线上的截距4)三者关系三者关系：W=4=1.699W1/2第48页/共87页49拖尾因子拖尾因子又叫对称因子，用于衡量色谱峰的对称性在0.951.05之间，为对称峰 第49页/共87页50 第三节第三节 色谱法基本原理色谱法基本原理一一.两组分完全分离的条件两组分完全分离的条件二二.塔板理论塔板理论三三.速率理论速率理论四四.分离度分离度五五.色谱分离方程色谱分离方

20、程第50页/共87页51 组分A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓 第51页/共87页52 一一.两组分完全分离的条件：两组分完全分离的条件：两组分的分配系数必须有差异两组分的分配系数必须有差异区域变宽的速度要小于区域分区域变宽的速度要小于区域分离的速度离的速度在保证快速分离的前提下，提在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱供足够长的色谱柱第52页/共87页53二二.塔板理论塔板理论塔板理论塔板理论是为了研究是为了研究谱带谱带在柱内在柱内的的展宽机理展宽机理，人为设计的一种，人为设计的一种物物理模型。理模型。把把色谱柱色谱柱比作一个比作一个精馏塔精馏塔，沿用，沿用精馏塔中精馏塔中塔板塔板

21、的概念来描述的概念来描述组分组分在在两相间两相间的的分配行为分配行为。第53页/共87页54 塔板理论把色谱柱看作一个精馏塔板理论把色谱柱看作一个精馏塔，假想塔内有塔，假想塔内有N块相连接并相块相连接并相等的塔板，在每块塔板的间隔内，等的塔板，在每块塔板的间隔内，组分混合物在两相中分配并达到组分混合物在两相中分配并达到平衡。经过一系列的分配平衡后，平衡。经过一系列的分配平衡后，分配系数最小的组分最先达到塔分配系数最小的组分最先达到塔顶，即最先流出色谱柱。顶，即最先流出色谱柱。第54页/共87页55 1.基本假设基本假设1）在塔内一小段长度在塔内一小段长度H内（即一块塔板内（即一块塔板的高度），

22、组分可在两相间瞬时达到的高度），组分可在两相间瞬时达到分配平衡。分配平衡。H称为理论塔板高度。称为理论塔板高度。2）流动相通过色谱柱时是不连续的，每）流动相通过色谱柱时是不连续的，每次进入量为一个塔板体积。次进入量为一个塔板体积。3）所有组分和新鲜流动相开始时都加在所有组分和新鲜流动相开始时都加在0号塔板上，忽略组分沿色谱柱方向的号塔板上，忽略组分沿色谱柱方向的纵向扩散。纵向扩散。4）分配系数在所有塔板上都是常数，与）分配系数在所有塔板上都是常数，与组分在塔板中的浓度无关。组分在塔板中的浓度无关。第55页/共87页56 2.塔板计算公式塔板计算公式色谱柱长度为色谱柱长度为L，该柱所具有的塔，该

23、柱所具有的塔板数，即组分平衡的次数为：板数，即组分平衡的次数为：n为理论塔板数，为理论塔板数，H为理论塔板高度。为理论塔板高度。L一定，一定，H，n。分配平衡的次数分配平衡的次数，柱效，柱效；第56页/共87页57 tR一定，一定，峰宽峰宽，则，则n，柱效，柱效 第57页/共87页583.有效塔板数有效塔板数neff用用tR代替代替tR 计算则得有效塔板数计算则得有效塔板数neff 更能反映色谱柱的实际效能更能反映色谱柱的实际效能第58页/共87页59注意：注意：比较柱效时，必须表明组分的名称、比较柱效时，必须表明组分的名称、固定相及含量、温度、流动相、流固定相及含量、温度、流动相、流速等条件

24、，不同组分在同一色谱柱速等条件，不同组分在同一色谱柱上的上的n不同。不同。计算计算n时，保留值与时，保留值与W1/2单位必须要单位必须要统一。统一。第59页/共87页60 用苯用苯-甲苯的甲醇溶液测定一甲苯的甲醇溶液测定一20cm长色谱柱的柱效，色谱数据如下表，试计算苯长色谱柱的柱效，色谱数据如下表，试计算苯和甲苯的和甲苯的n，H及及Rs tR(min)A W1/2(min)苯苯 4.62 2045323 0.11甲苯甲苯 6.13 2202457 0.12第60页/共87页61三三.速率理论速率理论Van Deemter方程方程速率方程速率方程色谱过程动力学速率理论色谱过程动力学速率理论涡流

25、扩散项涡流扩散项 分子扩散项分子扩散项 传质阻力项传质阻力项第61页/共87页62 板高板高-流速曲线流速曲线1.B/u 2.Cu 3.A 4.H第62页/共87页63四四.分离度分离度1.柱效和选择性柱效和选择性2.分离度分离度Rs 第63页/共87页64 1.柱效和选择性柱效和选择性衡量柱效的指标是理论塔板数衡量柱效的指标是理论塔板数（或（或neff）柱效反映分离过程的动力学性质。柱效反映分离过程的动力学性质。衡量色谱柱的选择性是色谱图上两峰间衡量色谱柱的选择性是色谱图上两峰间的距离，距离越大说明柱子的选择性越的距离，距离越大说明柱子的选择性越好。好。分配系数比表示两组分在给定柱子上的分配

26、系数比表示两组分在给定柱子上的选择性。选择性。柱子的选择性主要取决于在固定相上的柱子的选择性主要取决于在固定相上的热力学性质。热力学性质。第64页/共87页652.分离度分离度Rs分离度又称分辨率，是指相邻两峰顶间距离与两峰底宽平均值的比值。第65页/共87页66Rs=1,基本达到分离基本达到分离,分离效果达到分离效果达到98%Rs=1.5,完全分离完全分离(基线分离基线分离),分离效果分离效果99.7%Rs=2,充分而完全分离充分而完全分离,分离效果为分离效果为99.9%第66页/共87页67五五.色谱分离方程式色谱分离方程式a b ca为柱效项，为柱效项，b为柱选择项，为柱选择项，c为柱容

27、量项为柱容量项第67页/共87页68 容量因子（k）、柱效（n）及分配系数比（）对分离度Rs的影响第68页/共87页69 1.分离度与柱效的关系分离度与柱效的关系增加柱长来增加塔板数。增加柱长来增加塔板数。n大大Rs增大，但会延长分析时间。增大，但会延长分析时间。设法降低板高设法降低板高H，才是增大，才是增大n的最的最好办法。好办法。第69页/共87页70 2.分离度与选择因子关系分离度与选择因子关系的微小增大，都会使分离度得到较的微小增大，都会使分离度得到较大的改善，当大的改善，当2时，在很短的时时，在很短的时间内组分就会完全分离。间内组分就会完全分离。K1=K2，=1，则，则Rs=0，无法

28、分离，无法分离K2和和K1相差越大，相差越大，增大，说明色增大，说明色谱系统选择性好，分离效果好。谱系统选择性好，分离效果好。第70页/共87页71 3.分离度与容量因子关系分离度与容量因子关系k2为色谱图上相邻二个组分的第二为色谱图上相邻二个组分的第二个组分的容量因子。个组分的容量因子。增大容量因子项可以增加分离度增大容量因子项可以增加分离度当当k2从从0增加到增加到时，时，c项从项从0变到变到1通常通常k值选在值选在110，适宜的，适宜的k一般一般为为27。第71页/共87页724.色谱分离方程式应用色谱分离方程式应用柱效、选择性及容量项对分离度的影响第72页/共87页73 小结：小结：柱

29、效高低主要取决于色谱峰的尖柱效高低主要取决于色谱峰的尖锐程度，色谱峰越尖，柱效越高。锐程度，色谱峰越尖，柱效越高。选择性好坏可从两色谱峰间的距选择性好坏可从两色谱峰间的距离来判断，两峰隔得越开，选择离来判断，两峰隔得越开，选择性越好。性越好。容量因子的大小可从色谱峰的保容量因子的大小可从色谱峰的保留时间观察，保留时间越长，容留时间观察，保留时间越长，容量因子越大。量因子越大。第73页/共87页74第四节 色谱分析定量方法（1）归一化法（2）外标法（3）内标法第74页/共87页75（1）归一法：把所有出峰组分的含量之和按100%计算的定量方法。根据单个峰面积对总面积的比，即可求出峰组分的百分比含

30、量。第75页/共87页76归一化法fi重量校正因子第76页/共87页77绝对校正因子相对校正因子第77页/共87页78（2）外标法：以与欲测组分的纯物质作参比物，根据样品量、参比物的量和它们的响应信号有一定的函数关系而进行定量的方法。（3）内标法：选择样品中不含有的纯物质作为内标物加入待测样品溶液中，以待测组分和内标物质的响应信号对比，测定待测组分的含量。第78页/共87页79 外标法内标法标准曲线法 一点法两点法内标法校正因子法第79页/共87页80 标准曲线法 y=ax+b第80页/共87页81一点法第81页/共87页82二点法第82页/共87页83内标校正因子法：由对照品溶液得到校正因子

31、，在相同条件下分析，若已知取样量及样品中内标的准确量，即可由样品色谱图的被测组分和内标的峰面积计算被测组分含量。第83页/共87页84内标校正因子法第84页/共87页85 精密称取精密称取0.4068 g CH3OH为内标物，测冰醋酸的含水量。精密称取样品冰为内标物，测冰醋酸的含水量。精密称取样品冰醋酸醋酸40.68 g，测得，测得H2O面积为面积为2036578，甲醇面积，甲醇面积2582634，试以内标法，试以内标法计算冰醋酸中以重量计算冰醋酸中以重量%表示的含水量（表示的含水量（CH3OH的的f为为1.00，H2O的的f为为20.0）。）。第85页/共87页86用高效液相色谱法测定葛根素

32、注射液中葛根素的含量。已知对照品的浓度为用高效液相色谱法测定葛根素注射液中葛根素的含量。已知对照品的浓度为0.1002mg/ml，进样，进样10ul，色谱峰面积为，色谱峰面积为2063785；精密量取待测葛根素注；精密量取待测葛根素注射液射液0.5ml至至10ml容量瓶中，加重蒸水至刻度，得供试品溶液。将供试品溶容量瓶中，加重蒸水至刻度，得供试品溶液。将供试品溶液在相同色谱条件下进样液在相同色谱条件下进样10ul，色谱峰面积为，色谱峰面积为2043272。已知葛根素注射液。已知葛根素注射液的标示量是的标示量是2mg/ml，其标示量的合格范围为，其标示量的合格范围为93107，试判断样品是，试判断样品是否合格。否合格。第86页/共87页87感谢您的观看！第87页/共87页