PCR技术的过程和意义.pdf

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1、PCR 技术的过程和意义一、一、PCRPCR 技术的基本原理技术的基本原理类似于 DNA 的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR 是一种体外 DNA 扩增技术,是在模板 DNA、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促合反应，将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物延伸三步反应的多次循环，使 DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于个复杂的混合物如细胞提取液中,且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得

2、不敏感。使用 PCR 技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。二、二、PCRPCR 技术的步骤技术的步骤PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1、模板 DNA 的变性模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板 DNA 与引物的退火(复性）模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸DNA 模板-引物结合 物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以

3、 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。三、三、PCRPCR 技术的意义技术的意义1、特异性强PCR 反应的特异性决定因素为:引物与模板 DNA 特异正确的结合;碱基配对原则；Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性;靶基因的特异性与保守性.其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的

4、结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及 TaqDNA 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高.2、灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（g=-6)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌.3、简便、快速PCR 反应用耐高温的 Taq DNA

5、聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA扩增液和水浴锅上进行变性退火-延伸反应，一般在 24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素,无放射性污染、易推广.4、对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA 扩增检测。四、四、PCRPCR 技术主要应用的领域技术主要应用的领域1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称 PCR 制备单链 DNA 用于 DNA 测序3、反向 PCR 测定未知 DNA 区域4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、

6、RNA 病毒量以及直接克隆特定基因的 cDNA5、荧光定量 PCR 用于对 PCR 产物实时监控6、cDNA 末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病;诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。五、关于五、关于 RT-PCRRT-PCR4 月 17 日，在北京检验检疫局承担的国家质检总局科技计划项目“禽流感病毒 H7N9 亚型双重荧光 RTPCR 定型技术研究”鉴定会上,专家组一致认为：该项目创新性地实现了对禽流感病毒 H7N9 亚型的一步快速定型，可在一次检测中确认样品中是否存在 H7N9 亚型禽流感病毒或其他 H7 亚型和 N9 亚型的禽流感病毒；在通用性、特异

7、性、灵敏性上,技术优势突出。专家组同意项目成果通过鉴定，并建议在进一步扩大和完善动物临床验证实验基础上，尽快推广应用。RTPCR 为反转录 RCR（reverse transcription PCR）和实时 PCR（real timePCR）共同的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reverse transcriptionPCR,RTPCR),是聚合酶链式反应(PCR）的一种广泛应用的变形。在 RTPCR 中,一条RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过PCR 进行 DNA 扩增。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。作为模板的 RNA 可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何种 RNA,关键是确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA的污染.利用 RTPCR 技术，也许在不久的将来，H7N9 的快速诊断将成为一个非常容易的问题。