临床生化检验应用工程师基础知识培训.pdf

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1、临床生化检验应用工程师基础知识培训 1/23 临床生化检验基础知识培训 一、生化基础知识 1.1 生化诊断试剂盒为由一定的化学品或者酶类组成的多成分混合试剂（Reagent），最终以水溶液的方式与待测物发生一系列化学或者生化反应，通过生成物或反应物中某物质的吸光度变化，测量待检测物中某种特定物质的含量。1.2 生化诊断试剂用于检测样本，包括：人体血清（主要）、血浆及尿液中的各种酶类和代谢产物，用于预测，诊断以及治疗监测，协助临床医生诊治疾病提供数据参考。1.3 按功能分为：肝功、血脂、肾功、心肌、代谢、免疫&风湿、离子&其他。1.4 试剂性能评价指标：1 试剂外观 2 批间差 3 准确度 4

2、精密度 5 线性（灵敏度）6 抗干扰能力（特异性）7 稳定性 1.5 试剂检测原理（朗伯比尔定律）：A=Kbc 式中，A 为吸光度;K 为吸收系数，是与入射辐射的波长及吸收物质的性质有关的常数;b 为液层厚度，单位为 cm;c 为吸收物质的浓度。当浓度的单位为 mol/L 时，K 的单位为 L/molcm，称为摩尔吸收系数，通常用 表示。摩尔吸收系数 表示物质对某一波长的辐射的吸收特性。愈大，表示物质对某波长辐射的吸收力愈强，因而分光光度法测定的灵敏度就愈高.1.6 理论值与实测值偏差的解释：实测值偏离了朗伯比尔定律。偏离 Lambert-Beer 定律的因素：1 复合光对 Beer 定律的偏

3、离：吸收定律要求入射光为单色光，而分光光度计单色光的纯度主要决定于色散元件及光路设计，即使高精度的仪器，也得不到纯单色光，而是波长宽度的复合光，其结果导致偏离Lambert Beer 定律。2 杂散光的影响：杂散光(stray light)是进入检测器待测波长以外的光。主要来源于仪器色散元件表面的散射、单色器内壁尘埃等。3 狭缝宽度的影响：单色器设有进、出口狭缝，狭缝愈窄，单色光愈纯，吸光度增加，但辐射能减小，对弱吸收带的测量有一定影响。定性分析时，为提高分辨能力常采用较小的狭缝，而定量分析时，在灵敏度允许的情况下，宜采用较大狭缝。当出、入射狭缝宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小。4 非吸收作

4、用引起的误差：1.散射效应：光吸收定律只适用于均匀的吸收体系，如待测溶液是混浊的，当光通过时，将产生散射效应。其结果使光通过吸收物质的光程不固定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致偏离 Beer 定律。因此，免疫比浊法常用多点校准来做标准曲线。临床生化检验应用工程师基础知识培训 2/23 2.荧光效应：分子吸收辐射能后产生的激发态分子以重新发射辐射的方式回到基态而发射荧光。由于多数显色体系荧光效应很小，而且荧光发射是各向同性，只有一部分沿透射光方向进入检测器，使测量吸光度偏低。一般情况下，荧光效应对分光光度法产生的影响较小。目前，多数光度计设有两个样品室，对有荧光试样可置于离检测器较远

5、的样品室，或在光路中插入适当的滤光片以消除荧光效应。5 测定过程中产生的误差：化学反应引起的误差，人为的误差等，在此不作详细解释。1.7 生化测定方法：临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、固定时间法等。1.8.1 生化分析基本术语概述：1 双波长：由主波长和副波长构成的两个波长，测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时，为消除其他干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。2 反应杯空白：在特定波长下，光通过以蒸馏水或空气为反应体系所测得的吸光度值。3 试剂空白：在各特定波长下，光通过以蒸馏

6、水或生理盐水为样品和相应测定项目试剂构成的反应体系时所测得的吸光度值。4 样品空白：在各特定波长下，光通过以生物样品和相应测定项目（不含有引起反应的一种或多种成分的试剂）构成的反应体系所测得的吸光度值；或由生物样品和相应测定项目试剂构成的反应体系产生反应最初时间所测得的吸光度值。5 终点法：这是最常用的分析法。因为该法常有标准液，因此又称比例终点法，是经过一定反应时间后，当反应达到平衡(终点)时做到的一点分析法。一般是在一定温度下，试剂与样品经过一定反应时间，被送入比色系统，然后检测吸光度的变化，由微机系统处理计算和打印显示出结果。其中又分一点终点和两点终点法。6、连续监测法：也叫速率法，此法

7、通过测定酶所催化的反应速度，间接计算出酶的含量，称酶活性测定法。在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物(ES)，底物浓度开始下降，此时产物尚未生成。当复合物(ES)分解，生成产物(P)，酶促反应速度急骤上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。随酶促反应继续进行，底物不断消耗，酶促反应条件逐渐变化，酶促反应速度逐渐减慢，产物生成或底物减少量的变化曲线遂趋平坦，这一时期称为一级反应期。此时的反应速率常常不能准确反应酶的含量。因此其测

8、光点一般要求取在反应达到平衡前。7、两点速率法：两点速率法也叫固定时间法，对测定及标准采用两个时间点测定。采用此方法的如肌酐（苦味酸法），目前多数自动分析仪还是用 Jaffe 氏反应测肌酐，即肌酐能同碱性苦味酸盐生成红橙色化合物，这个反应特异性不高，因为维生素 C、丙酣酸、丙酣、葡萄糖、乙酷醋酸、果糖、氨基马尿酸、蛋白质及其他反应产物亦能与碱性苦位酸盐生成红色化合物，血清中的这些假肌酐约含 25%。但真性肌酐与苦味酸的反应为快反应，假肌酐为慢反应，因此测试时测临床生化检验应用工程师基础知识培训 3/23 试时间一般在样品与碱性苦味酸试剂混合后 25 秒和 1 分 25 秒在 500nm 处测吸

9、光度变化。两时间点的吸光度变化之差，则为特异反应肌酐浓度。8 普通免疫比浊与胶乳增强免疫比浊法：普通免疫比浊法：是抗原与相应的抗体直接结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。胶乳增强免疫比浊法：是将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，制成致敏的胶乳颗粒，当遇到相应抗原时，发生交联反应，形成抗原抗体复合物，胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，

10、即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。该法比普通免疫比浊敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高。9 参考物的量值溯源性:通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链,使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准,通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。10 检测限：是指检测系统可检测出的最低分析物浓度。又称分析灵敏度。11 灵敏度与线性范围：灵敏度与线性范围有着紧密联系，这也是跟生化仪的性能有关。灵敏度与线性范围的取舍就要根据其医学决定水平而定。一般仪器能测的光 密度值最大在 35000。假设谋项目的医学决定水平在 0100，如果

11、 1 个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为 1000，那么它能测的浓度范围为 035，可以看出，虽然其灵敏度很高，但在其检测范围没有达到其医学决定水平，即线性范围太窄。相反，如果 1 个单位浓度变化能引起仪器吸光度响应量为100，那么它能测的浓度范围为 0350，这个线性范围是可以的。因此，灵敏度与线性的评价，要根据其医学决定水平而定。1.9 常用校准方法：终点法或两点速率法，必须通过使用标准液，建立一条标准曲线；速率法，采用标准液校正可消除系统误差，也可直接输入Factor 值。校准类型：空白定标：以水做标准液，消除试剂本身对测试的干扰；（酶类）两点定标：以水作为零点，标准液作为另一点，建

12、立标准曲线；（Y=AX+B）多点定标：两个以上的标准液建立一条标准曲线；（LOGIT-LOG）1.10 参考区间与医学决定水平：临床实验室检验结果对被检验者低正常还是异常，有何临床意义，如何用检验结果协助临床医生诊断和治疗，这就涉及到参考区间和医学决定水平了。参考区间大多是采用正态分布的原理制定，以95%的分布区间（x2s）即为参考区间的上、下限，少数用百分位数来制定参考区间。不论采用什么方法，总有少数正常人的测定值落在异常范围内。因此，假性结果是避免不了的。当结果接近上限或下限时，不要轻易下正常或有病的结论，要根据被测者的其他表征综合判断或过一段时间复查后，再做分析。医学决定水平是由 Bar

13、nett 于 1968 年首先提出的。是指临床上必须采取措施时的检测水平。决定性水平是一个阀值，高于该值或低于该值，应决定对患者采取适当的治疗措施。医学决定水平可在疾病诊断中起着排除或确认的作用，对临床生化检验应用工程师基础知识培训 4/23 某些疾病进行分级或分类，或愈后做出估计，来提醒医生在临床上做出相应的处理方式。医学决定水平与参考区间的区别在于它不仅对健康人的数值进行研究，以决定健康人的范围，同时还对有关疾病的不同病情的数据进行研究，以定出不同的决定性限值，以引导医生采取不同的临床措施。它的应用可以克服只使用参考范围的缺点，使一个检验结果对病人能起到提供诊断，处理依据的作用。1.11

14、酶法检测基本知识：酶是由活细胞产生并能在体内起催化作用的，一类特殊蛋白质。体内几乎所有的代谢反应都是在不同的酶催化下进行的。酶的催化效率高，对底物有严格的选择性，酶非常不稳定，酶浓度的变化是许多疾病的敏感指针，这是建立和发展诊断酶学的依据。用酶作试剂(工具酶)测定非酶物质具有效率高、特异及易于实现自动分析的特点，是目前临床生化检验的主流方法。1.11.1 酶促反应速度的因素：包括:酶的浓度、底物的浓度、激活剂与抑制剂、pH 和温度等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时，反应系统中其他因素不变。酶促反应中所指速度是初速度，因为这时的反应速度与酶浓度成正比，可以避免产物及其他因素对反应速度的影响

15、。在建立定量测定酶活性的方法时，需要研究酶促反应的速度及影响此速度的因素，通常称之为反应动力学。1.11.2 酶活力测定 酶的含量很低，除免疫学方法外，不能直接测定其含量，只能测其催化反应过程中一定时间内物质变化的量，即酶促反应速率，或称酶的活力。要保证只有待测酶的量影响反应速率，其他各种影响反应速率的因素都在严格控制之下，并保持各测定间的一致性。（一）酶促反应的过程 通过测定底物浓度的下降，或测定产物浓度的上升，可以追踪酶反应过程中底物转变为产物的过程。通常多测定产物的形成，因为测定产物从零或者从低浓度的增加，比测定高浓度底物的下降更可靠。典型的酶反应过程曲线分为几个时期。紧随着加人血清或底

16、物启动反应后，在出现明显的变化前为延迟期;此期从几秒到几分钟。随后是底物和产物变化与时间成直线的时期，形成产物的速率恒定，此时期的速率为反应初速度。此期底物也下降，但实际上反应速度与底物浓无关，对底物浓度而言，酶促反应实际上是零级反应。反应曲线的直线期时间长短相差悬殊。紧跟着是反应速率持续下降，进入速度依赖于底物浓度的一级反应期。在这一期中，底物浓度下降，逆反应增加，抑制性产物蓄积，乃至酶本身进行性的灭活等因素也起作用。最后，当底物起尽或达到平衡时，反应停止。在零级反应期中，测定一定时间内形成产物的量，是以此期中速率维持恒定为条件。否则表观的反应速率将不正比于酶浓度。也就是选择的监测点必须在反

17、应速率恒定区（零级反应期）。在正常测定中，为了能缩短延迟期和延长线性期，不仅要适量的底物浓度，还要在试剂中加入某些激活剂和其他的辅助因子。以改善反应进程曲线。(二)固定时间法和连续监测法 在我国临床实验室中，目前测定酶活性的方法，已从手工操作的固定时间法及两点测定法过渡到连续监测法。固定时间法在反应过程中测定一点的吸光度;两点测定法是在反应开始及反应经一定时间后，分别测两点的吸光度，根据两点间吸光度的差值，推算酶的活力。固定时间法和两点测定法都是在酶和底物孵育一段时间后测定总的变化。两点测定法也应属于酶动力学测定方法，但动力学测定法这一术语，习惯上仅指多点测定的动力学方法，即所谓速率法或连续监

18、测法，不论用手工法或自动法。固定时间法和两点测定法临床生化检验应用工程师基础知识培训 5/23 可能会有几种误差:酶活力非常高的样品，由于底物消耗速度快，反应很快呈现迟缓或停止；有一些反应类型延迟期长；某些标本的反应曲线可能是非线性的；活力高的标本，超出了限定的活力测定范围，若稀释标本可能会引起催化活力不成比例的变化。由于光度计及方法学的改进，可以缩短孵育时间，增加酶活力测定范围，缩短延迟期，增加线性期，使固定时间法仍发挥重要作用；尤其在中小医院实险室中更有实用价值，甚至一部分生化分析仪也采用了固定时间法。1.11.3 酶法分析 酶法分析即酶作为分析试剂，有利于提高测定结果的特异性;不需要先将

19、测定的物质分离和提纯;可以直接分析血清这样复杂的濡合物。具有绝对特异性的酶，即只作用于某一种物质的酶，特别适合分析用。尿酸氧化酶、尿素酶、葡萄糖氧化酶特异性高。但实际上不能都如此。因此，必须了解酶对底物的特异性，从而预料可能发生的干扰反应并设法纠正。在以酶作分析试剂测定某-物质时，也可用偶联反应;而且偶联反应的特异性可以增加反应全过程的特异性。如用己糖激酶(HK)法测葡萄糖，HK 也作用于果糖产生相应的 6-磷酸醋;但偶联的指示反应是 G6PD，它特异地催化葡萄糖-6-磷酸的反应，用此酶测定己糖激酶催化反应的产物，明显地提高了偶联系统的特异性。(一)传统的酶法分析非酶物质方法 以酶作试剂进行分

20、析的方法有两种。广泛应用的第一种方法，是使反应进行到完全，使全部底物转变成产物，称终点法。这是最理想的分析类型。但是，在非理想的平衡时，底物远未完全转变。此时需增加酶或非酶的反应，以转变或捕获第一个反应的产物，使反应在所要求的方向上进行到完全。如用乳酸脱氢酶测定乳酸中，形成的丙酣酸，通过加入硫酸阱形成腺而捕获丙酣酸，使反应达到完全。第二种方法是动力学法，即间隔一定的时间测定底物的变化量(=速率)。由酶促反应进程曲线已知，开始为高底物浓度由酶催化的反应，首先服从零级反应，然后随着底物浓度减低，进入一级反应期。对于任何一级反应，反应开始后在一给定时间 t 的底物浓度(S)为:(S)=(So)*e-

21、kt (So)是最初的底物浓度，e 是自然对数的底，K 是速率常数。在 t1 到 t2 的固定时间间隔中，底物浓度的变化量(S)与(So)的相互关系为:(So)=-(S)/(e-kt-e-kt2)也即在一固定时间间隔中，底物浓度的变化量正比于底物的初浓度。这是一级反应的通性。对于酶的反应，当(S)Km 时，米氏方程简化为:V=(Kmax/Km)*(S)K 为一级速度常数。在反应过程中的两个固定时间，测量与底物浓度性质相关的(如光吸收)的方法为两点动力学法。从理论上讲，这是用酶法测定底物的最准确的方法；但方法学上比平衡法要求高，所有影响反应速率的因素如 pH、温度及酶量必须在两点分析中保持恒定，

22、并准确定时。必须用标准液进行校正。为保证一级反应条件，底物浓度必须低至小于 O.2xKm。酶对底物的 Km 要高，以便测出较宽范围的底物浓度。为增加试剂酶的表现 Km 值，可引进竞争性抑制剂。此外，被测非酶物质作为酶促反应激活剂者，则用连续监测法，如无机离子钾和钙的酶法测定。临床生化检验应用工程师基础知识培训 6/23(二)酶循环法分析非酶物质 酶循环法(enzymatic eyeing method)，是利用酶的底物特异性放大靶物质(被测物)以提高灵敏度的测定方法。只循环靶物质，减少了样品存在的其他物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质进行提取，而且不需要特殊设备，是一种很有

23、前途的测定技术。利用酶循环法测定的项目主要是总胆汁酸（TBA）。二、生化仪器基础知识 2.1 检验科常见全自动生化分析仪：日立：7100、7170、7080、7180、7600，奥林巴斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400 贝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800,AU480，AU680，AU5800 东芝：TBA-40、TBA-120 雅培：2000、C8000、AEROSET 拜尔(西门子)：ADVIA1200、ADVIA1650、ADVIA2400 2.2 下面简单介绍几个常用品牌的相关仪器性能 日立：现在各医院所用日立仪器的型号主要为 7180、7600，

24、除 7080 为 31 个测光点外，其余都为 34 点。以下为 7180 仪器主要性能介绍：分析速度：800 个测定/小时（最大），约 4.5 秒加样一次 可分析项目：86 项（带 ISE 的话，最大可达 89 项），计算项目 8 项 样本量：1.535.0l，0.1l 可调；试剂量：20270l，1l 可调；总反应体积：120300l；测光时必须满足该条件；光源灯：保质期 750 小时；比色杯：20 只8 组共 160 只，依据杯空白值进行更换；测光系统：采用凹面蚀刻光栅的后分光、双波长测定方式；12 个波长：340、405、450、480、505、546、570、600、660、700、7

25、50、800nm 稳定性高且可有效补偿样本混浊、溶血、黄疸及电源电压变动引发的干扰 测定过程：全反应监测，10 分钟测定 34 次吸光度值。15 分钟测定 53次吸光度值 依据实验要求选择相应测光点的吸光度值计算结果 样本容器：样本针有液面探测装置，可使用原始采血管离出血清后直接上机测定 试剂：同一项目最多可加入四步试剂，两试剂舱位置各 45 个，温度515。临床生化检验应用工程师基础知识培训 7/23 奥林巴斯：AU400、AU640、AU2700、AU5400 奥林巴斯生化仪已经被贝克曼收购，除 AU400、AU640、AU2700、AU5400外，还有一款 AU680，其操作界面为贝克曼

26、公司设计，但主要性能跟以往的 AU640 基本保持一致。测光点为 27 个，R2 试剂在 1011 点加入。以下为 AU400/600/640 等型号设参数需了解的仪器性能：Sample vol（样品量）：250,可以按 0.5ul 为单位增减。Reagent 1 vol（第一试剂量）：25-300,可以按 1ul 为单位增减。Dil vol(稀释液-吐水量)：一般用浓缩试剂时才用。Reagent 2 vol（第二试剂量）：25-300，可以按 1 为单位增减。Dil vol(稀释液-吐水量)：一般用浓缩试剂时才用。第二试剂是固定的 10-11 点之间加入的。测定波长共有13种：340,380

27、,410,450,520,540,570,600,660,700,750,800nm。Method（方法学）共六种：End,Rate,Fixed;End1,Rate1,Fixed1。前三种与后三种的差别为：前三种是以试剂为空白的，后三种是以比色杯为空白的。Reaction（反应方向）：-，+。End 与 Fixed 法不起作用，但是 Rate 法一定要输正确。Linearity（线性）：Fst，Lst，Rate 法才输入，一般国产试剂 30%；进口试剂：15%。No-Lag-Time：Rate 法才输入，在读点期内，如果反应太快，超过线性（Linearity 限）仪器会自动用线性比较好的那一段

28、来计算。试剂空白 OD 限：Fst 指的是 0 点，Lst 指的是 27 点。只对 Rate 法有用，一般向下的反应，输 0.92.5，向上的反应-2.00.8。下图显示屏幕上的基本显示模型 临床生化检验应用工程师基础知识培训 8/23 贝克曼：CX3、4、5、7、9、LX20、DXC800，贝克曼仪器是作为急诊用的优先选择仪器，其有较高的准确度，精密度和稳定性，抗交叉污染也是一流的，但不适合常规大量样本的检测，其试剂消耗量也是现有仪器中临床生化检验应用工程师基础知识培训 9/23 比较大的。贝克曼仪器波长数为10个，340,380,410,470,520,560,600,650,670,70

29、0nm。监测时间不是以周期（点）计，而是以秒来计，每 8S 测一次吸光度。加样时间为第 0s,第二次灌注时间为-180s，或 9738s。贝克曼仪器必须用两个波长测定，否则仪器不运行，在设参数时必须符合这一规律。临床生化检验应用工程师基础知识培训 10/23 拜尔（西门子）：ADVIA2400，测试速度 2400 Test/小时，比色法 1800Test/小时，电解质 600 测试/小时。其中有波长：340/410/451/478/505/545/571/596/658/694/751/805/845/884nm 14 个。临床生化检验应用工程师基础知识培训 11/23 测试方法：终点法（EP

30、A）、速率法（RRA）、两点速率法（2PA）及多点均相免疫分析。微量取样技术：所有的样本按 1:5 比例进行预稀释处理（30ul 样品+120ul生理盐水）一般可作 15 个项目分析。微量技术加试剂保证每测试平均试剂体积为 80ul-120ul，理论上 1mL 的试剂能做 12.5 个测试，最低也能做到 8 个测试。体现了其最大优点就是省试剂。不同型号的生化仪每毫升试剂测试数是不一样的，以下是各品牌的理论测试数：7170：180-380ul 5.5 T/ml 7060：250-500ul 4 T/ml AU400:150-350ul 6.6 T/ml BECKMAN:200-330ul 5 T

31、/ml TBA-40:120-360ul 8.3 T/ml TBA-120:80-360ul 12.5 T/ml ADVIA2400：80-120ul 12.5 T/ml 进口仪器 4-5 人份/毫升；国产仪器 3-4 人份/毫升 三、各生化项目的临床意义及其检测原理：3.1 肝功能测定项目 3.1.1 血清总胆汁酸TBA：胆汁酸是由胆固醇在肝脏中分解代谢所生成的，肝胆、肠、门静脉都参与胆汁酸的自主循环过程。胆汁酸主要存在于肝肠循环系统并通临床生化检验应用工程师基础知识培训 12/23 过再循环起一定的保护作用。只有一少部分胆汁酸进入外周循环。促进胆汁酸肝肠循环的动力是肝细胞的转运系统棗吸收胆

32、汁酸并将其分泌入胆汁，经胆囊诱导的胆囊收缩，小肠的推进蠕动，回肠粘膜的主动运输从血液经门静脉流入。血清中胆汁酸的水平是反映肝脏损伤的重要指征，一旦肝细胞发生病变，血中胆汁酸浓度极易升高。急性肝炎、慢活肝、肝硬化、肝癌，TBA结果明显升高。与ALT比较，急性肝炎、慢性活肝ALT、TBA都较敏感，但肝硬化、肝癌两种结果差异明显：TBA阳性率高达95%，而ALT阳性率仅为20%。因此，TBA测定用于监测慢性肝病价值很大。其测定方法简单，是一项很具实用价值的肝功能诊断指标。检验原理:血清中的胆汁酸（3-羟类固醇）会被3-羟类固醇脱氢酶（3-HSD）及-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD+)

33、特异性地氧化，生成3-酮类固醇，同时 Thio-NAD+被还 原成 -硫 烟酰胺 腺嘌 呤二 核 苷酸还 原型(Thio-NADH)。新生成的3-酮类固醇在3-羟类固醇脱氢酶（3-HSD）及-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)存在下，还原成胆汁酸，同时NADH氧化成-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型（NAD+）。通过酶的循环反应，微量胆汁酸的量被放大。在405 nm处测定Thio-NADH吸光度的变化值，可求得血清中胆汁酸的含量。3.1.2 谷丙转氨酶ALT/GPT：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，又称谷丙转氨酶，主要存在于组织细胞中，正常状况下只有极少量释放入血液中，所以此酶在血清中活性很低。当组

34、织发生病变时，组织细胞中ALT就大量释放于血液，使血清中该酶的活性升高。血清中ALT主要来源于肝脏，各种肝炎活动期、肝癌、肝硬化和阻塞性黄疸时ALT的活性显著增高，心肌梗塞时ALT的活性仅有轻度增高。检验原理:本法为IFCC推荐的测定丙氨酸氨基转移酶的动力学方法，在ALT速率法测定中酶偶联反应为：L-丙氨酸+2-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸 丙酮酸+NADH+H+LDH L-乳酸+NAD+在340 nm波长下检测NADH的氧化速率，吸光度的下降速率与ALT活性成正比。3.1.3 谷草转氨酶AST/GOT：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，又称谷草转氨酶，此酶在组织中分布很广，如心肌、横纹

35、肌、肝脏，其中心肌含量最高。心肌梗死后6-12小时开始增高，16-48小时达最高值，3-6天恢复正常。肝炎时，AST和ALT一样明显升高，急性期由于ALT清除率较慢，往往ALT大于AST活力。恢复时也是ALT较慢，AST/ALT 比值小于1。如转氨酶升高，且比值大于1常说明有慢性肝炎的可能，肝硬化则比值明显升高。因此，AST活性的增高意味着心肌或肝细胞损害的发生。检验原理:本法为IFCC推荐的测定天门冬氨酸氨基转移酶的动力学方法，在AST速率法测定中酶偶联反应为：L-天门冬氨酸+-酮戊二酸 AST 草酰乙酸+L-谷氨酸 草酰乙酸+NADH+H+MDH L-苹果酸+NAD+3.1.4 -谷氨酰转

36、移酶-GT：-GT主要用于诊断肝胆疾病。-GT明显增高见于原发/继发性肝癌、阻塞性黄疸、胆汁性肝硬化、胰头癌、肝外胆道癌等。轻度或中度增高见于传染性肝炎、肝硬化、胰腺炎以及嗜酒和长期服用某些药物（如苯巴比妥)者，在解释酶活性增高的原因时应全面考虑。临床生化检验应用工程师基础知识培训 13/23 检验原理:L-r-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺+双甘氨肽 -GT L-r-谷氨酰双甘氨肽+5-氨基-2硝基苯甲酸 3.1.5 碱性磷酸酶 ALP：骨骼系统疾患如纤维骨炎、变形性骨炎、成骨不全症、骨质软化症、佝偻病、转移性骨瘤和骨折愈合期等可使 ALP 活性增高。肝胆疾患如阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝

37、炎、肝癌和肝脓肿等，以及甲状腺功能亢进、妊娠后期等均可使 ALP 活性增高。而重症慢性肾炎、儿童甲状腺功能不全、贫血、恶病质等则使 ALP 活性下降。检验原理:IFCC推荐的标准化测定方法，其原理是 以磷酸对硝基苯酚(4NPP)为底物，2氨基2甲基1丙酮(AMP)为磷酸酰基的受体物质，增进酶促反应速率。4NPP在碱性溶液中为无色，在ALP催化下，4NPP分裂出磷酸基团，生起游离的对硝基苯酚(4NP)，后者在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长 405nm处监测吸光度增高速率，计算ALP活性单位。3.1.6 白蛋白 ALB：血清白蛋白在肝脏合成。在营养不良的病人中可看到很低水平的血浆

38、白蛋白。另外，血液稀释或由于营养不良，肝脏疾病使合成白蛋白能力下降，或由于肾病综合症、蛋白丢失性肠道疾病等均可导致低白蛋白。高白蛋白血症则常见于脱水或血液浓缩。检验原理:在pH=4.2的酸性条件下，白蛋白作为一种阳离子，结合阴离子染料溴甲酚绿(BCG)，生成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰。其吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白的含量。3.1.7 总蛋白TP：血液中水分增加，营养不良和消耗增加，肝脏疾病以及肾病综合症等均可导致总蛋白水平下降。脱水症及免疫球蛋白增加的疾病则可使血清总蛋白水平增高。检验原理:在碱性溶液中，血清蛋白与二价铜离子反应生成紫色

39、络合物(双缩脲反应），颜色深浅与总蛋白的浓度成正比例关系。3.1.8 总胆红素TBIL/直接胆红素DBIL ：胆红素与重氮化对氨基苯磺酸（DSA）反应生成一种红色偶氮染料，在546nm波长处染料的吸光度与样本中胆红素的浓度成正比。水溶性胆红素葡萄糖醛酸直接与重氮化对氨基苯磺酸反应，而白蛋白结合的间接胆红素只有在促进剂作用下才能反应，总胆红素=直接胆红素+间接胆红素。检验原理:胆红素与重氮化对氨基苯磺酸（DSA）反应生成一种红色偶氮染料，在546nm波长处染料的吸光度与样本中胆红素的浓度成正比。水溶性胆红素葡萄糖醛酸直接与重氮化对氨基苯磺酸反应，而白蛋白结合的间接胆红素只有在促进剂作用下才能反应

40、，总胆红素=直接胆红素+间接胆红素。3.1.9-L岩藻糖苷酶AFU：AFU是溶酶体酶，其作用是分解岩藻糖甘油结合物。血清-L-岩藻糖苷酶（AFU)是肝细胞肝癌诊断的一个新标记物。在甲胎蛋白（AFP)阴性的原发性肝癌病例中，大约有7085出现AFU阳性结果，而且小细胞肝癌病人血清AFU的阳性率高于AFP。同时测定AFU与AFP，可使原发性肝癌的阳性检出率从单独测定AFP的70左右提高到90%94。因此，检测血清AFU活性，对肝癌的早期诊断和肝癌高发人群的筛查均有重要意义。检验原理:2-氯-4-硝基苯酚-L-岩藻吡喃糖苷在酶的水解作用下生成2-氯-4-硝基苯酚和-L-岩藻糖，可用速率法监测2-氯-

41、4-硝基苯酚，405nm波长处的吸光率的上升速率。反应速率与-L-岩藻糖苷酶的含量成正比，可计算出样本中-L-岩藻糖苷酶的活力。临床生化检验应用工程师基础知识培训 14/23 3.1.10 5-核苷酸酶 5-NT：5-NT 是一种特殊的水解酶。能特异性的将次黄嘌呤核苷酸水解为次黄苷和磷酸，此酶广泛分布在人体和动物的组织中，5-NT 经肝细胞膜进入胆汁，随之进入血清中 ，是检测肝胆疾病的重要指标。肝内外胆管阻塞，肝癌和伴随循环转移的乳房切除术后的病人此酶升高明显。诊断肝胆疾病和肝癌，5-NT 较其他酶类更敏感。检验原理：次黄嘌呤核苷酸+H2O 5-NT 次黄苷+磷酸 次黄苷+磷酸 核苷酸磷酸化酶

42、 次黄嘌呤+核酸-1-磷酸 次黄嘌呤+2 H2O+2 O2 黄嘌呤氧化酶 尿酸+2H2O2 2H2O2+EHSPT+4-AA POP 4H2O+红色醌类 3.1.11 腺苷脱氨酶ADA：ADA活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与ALT或GGT(-GT)等组成肝酶谱，能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中ADA活性的测定可用于判断急性肝损伤及残留病变；协助诊断慢性肝病；有助于肝纤维化的诊断有助于黄疸的鉴别：ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上有重要价值。结核性胸腹水ADA活性显著增高，癌性胸腹水不增高。此外，脑脊液ADA检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标，

43、结核性脑膜炎ADA活性显著增高，病毒性脑炎不增高，颅内肿瘤及中枢神经系统白血病稍增高。检验原理:本方法原理反应方程式如下：腺苷+H20 次黄苷+NH3 次黄苷+Pi 次黄嘌呤+1磷酸核苷 次黄嘌呤+H20+2O2 尿酸+2H2O2 2H2O2+4-AA+EHSPT 4H2O+醌(550nm)ADA酶解腺苷产生次黄苷，再应用嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)酶解次黄苷产生次黄嘌呤，然后通过黄嘌呤氧化酶(XOD)的作用，生成H2O2，再在过氧化物酶(POD)作用下生成醌色素。通过测量550nm处吸光度上升的速度，计算ADA的活性大小。3.1.12 胆碱酯酶 CHE：胆碱酯酶可用于有机磷杀虫剂和战争剂急慢性

44、中毒的诊断。在病情严重的肝炎患者中，约有五分之四的病人胆碱酯酶降低至正常的 60%，危重病人可降至正常的 10%以内，甚至完全缺乏。另外，慢性活动型肝炎、肝硬化均可导致胆碱酯酶活力下降。检验原理:胆碱酯酶催化水解丁酰硫代胆碱酯酶形成胆碱酯酶和丁酸盐。黄色三价铁氰化钾转化为无色二价亚铁氰化钾，吸光度降低程度与样本中胆碱酯酶活性成正比关系。3.2 血脂类测定项目 3.2.1甘油三酯TG ：甘油三酯升高：是冠心病的诱因之一。可引起冠状动脉粥样硬化、心肌梗塞、糖尿病、原发性高血脂症、肥胖症、急性胰腺炎、胆道梗阻、极度贫血等。甘油三酯降低：有严重营养不良，脂肪消化吸收障碍，甲亢等。检验原理:甘油三酯经酯

45、酶水解被测定，生成的过氧化氢，4-氨基安替比林和4-氯酚在过氧化物酶催化下生成醌亚胺。有色物质造成吸光度的改变与甘油三酯的浓度成正比。3.2.2 胆固醇 TCHO:长期的高胆固醇、高饱和脂肪和高热量饮食，遗传因素、缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可使胆固醇升高；遗传因素、甲亢、营养不良、慢性消耗性疾病等可使胆固醇降低。检验原理:胆固醇经酶水解和氧化被测定。在酚和过氧化物酶存在情况下，过氧化氢和4-氨基安替比林形成有颜色的醌类物质。3.2.3 高密度脂蛋白胆固醇HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇被视为防止冠心病的POD ADA PNP XOD 临床生化检验应用工程师基础知识培训 15/23 一种保护性

46、脂类成分，与低密度脂蛋白胆固醇一起对冠心病的危险因素进行评价。检验原理:乳糜微粒，极低密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇通过与抗人-脂蛋白抗体反应被特异性消除和破坏，在过氧化氢酶作用下水解。剩余的高密度脂蛋白胆固醇在加入特异性的表面活化剂后经胆固醇脂酶(CE)及胆固醇氧化酶(COD)等特异的酶促反应被测定。通过对蓝色结合物吸光度的测量对应得出HDL的浓度。这种方法要比其它检测方法更加特异。3.2.4 低密度脂蛋白胆固醇LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)被认为是导致冠心病(CHD）的脂质成份,与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C）同时检测，用于冠心病的诊断和风险评估。检验原理:本检测中第

47、一步反应通过酶反应特异性去除乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白胆固醇，保护LDL不与酶进行反应。第一步：HDL、VLDL、CM+H2O+O2表面活性剂 胆甾烯酮+脂肪酸+H2O2 2H2O2 过氧化物酶 2H2O+O2 第二步：通过酶反应和特殊的表面活性剂测定剩下的低密度脂蛋白胆固醇。通过对蓝色结合物吸光度的测量，得出LDL的浓度。LDL-C+H2O+O2 表面活性剂 胆甾烯酮+脂肪酸+H2O2 H2O2+色原 过氧化物酶 有颜色的醌类物质+H2O 3.2.5 载脂蛋白A1 APOA1：载脂蛋白的测定是评价心血管疾病危险因素的指标，对于发现和诊断载脂蛋白异常，研究载脂蛋白在脂类代谢和动脉粥

48、样硬化的发生有重要意义。ApoA(和ApoA一起)占HDL蛋白的80%-90%，因此，血清中ApoA可以代表HDL水平，与HDL-C呈明显正相关。ApoA降低主要见于高脂血症、冠心病、脑血管病、ApoA缺乏症、家族性低脂蛋白血症、鱼眼病等。检验原理:当样品与缓冲液和抗体混合，样品中的载脂蛋白A1与试剂中的抗人载脂蛋白A1抗体特异性结合,形成浊度增加，通过测定浊度的透光率判断样品中的载脂蛋白A1含量。3.2.6 载脂蛋白B APOB：载脂蛋白的测定是评价心血管病危险因素的指标，对于发现和诊断载脂蛋白异常，研究载脂蛋白在脂代谢和动脉粥样硬化的发生有重要意义。ApoB是LDL的主要蛋白质，因此，血清

49、中ApoB 主要代表LDL水平，与LDLC成显著正相关。高ApoB是冠心病的危险因素，也是较好的动脉粥样硬化标志物。银屑病患者ApoB也可升高。检验原理:当样品与缓冲液和抗体混合，样品中的载脂蛋白B与试剂中的抗人载脂蛋白B抗体特异性结合,形成浊度增加，通过测定浊度的透光率判断样品中的载脂蛋白B含量。3.2.7 脂蛋白a LP（a）：是含有独自的载脂蛋白(a)的脂蛋白，脂质组成结构与LDL极其相似，密度位于低密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间。1963年Berg发现Lp(a)时，因其病理意义不明，未被引起重视。1987年Mclean发现Lp(a)的一级结构与纤溶酶原部分相同，作为动脉粥样硬化的独立因子

50、越来越受到人们的重视。LP（a）水平的差异是由遗传因素决定的，受生活方式影响并不大。血清中高浓度的LP（a）可用为动脉粥样硬化和冠心病危险的一种有意义的指标。流行病学临床生化检验应用工程师基础知识培训 16/23 研究表明血清胆固醇正常，而血清脂蛋白（a）水平超过30mg/dl的人患冠心病的危险增加2倍。如果LDL和LP（a）水平同时升高其危险性增加8倍。检验原理：当样品与缓冲液和抗体混合，样品中的脂蛋白（a）与试剂中的抗人脂蛋白（a）抗体特异性结合,生成不溶性的沉淀物，引起浊度的增加，通过测定浊度的透光率判断样品中的脂蛋白（a）含量。3.3 肾功能测定项目 3.3.1 尿素 UREA：血清尿