植物生理研究技术兰科植物菌根及其共生真菌的初步研究wk.pdf

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1、兰科植物菌根及其共生真菌的研究概况兰科植物菌根及其共生真菌的研究概况XYZ2011兰科(Orchidaceae)植物种类繁多，分布广泛，是被子植物中的大科之一，是除菊科植物外的、最兴盛复杂的一类植物，全世界约有6个亚科725属近2500030000个原生种和大量的变种、品种，广泛分布于除两极和极端干旱沙漠地区以外的各种陆地生态系统中。包括了许多的著名药用植物和珍贵花卉，因而长期以来受到人们的普遍关注，科学家、园艺工作者也从各个角度对兰科植物进行了大量的研究。兰科植物的生活习性分为地生、附生和腐生。地生兰和附生兰为绿叶兰，腐生兰是非绿叶兰且在其生活史中仅开花期为地上生的，有些产于澳大利亚干旱地区

2、的腐生兰花甚至在地下完成其整个生活周期。兰科植物具有三大特点：第一、其花形状奇特，色彩艳丽，芳香宜人，授粉机制独特而复杂；第二、种子细小，仅具未分化的原胚；第三、在其生活史中，与真菌共生形成菌根。有关兰科菌根的研究，尤其是对植物种子萌发、早期生长及真菌在这一过程中的作用的广泛研究，使种子在人工控制条件下的共生与非共生萌发成为可能，为自种子培育兰科植物新品种提供了手段和依据，为研究兰科植物和真菌间的相互作用机制提供了较为理想的材料和方法。但是，对兰科植物菌根真菌的种类及成年兰根中植物与真菌的关系研究相对较少，本世纪80年代后对兰科菌根真菌的分类研究有了一些较为出色的工作。本世纪初，法国的 Ber

3、nard 和 Burgeff 真正揭开了兰科菌根之谜，认识到许多兰科植物没有菌根就不能正常的生长发育，甚至许多兰花的种子没有菌根真菌的感染就不能发芽。随后，国外开展了许多有关兰科菌根真菌在种子萌发方面的研究，主要集中在真能否促进种子萌发方面。七十至九十年代，对某些兰花的种子与菌根真菌共生萌发形成原球茎过程中的相互作用机制从结构方面作了较详细的论述，为自种子培育兰科植物新品种提供了手段和大量依据，但在菌根真菌的应用上，则以我国在天麻生产上的应用最为成功。另外，兰科植物菌根真菌的分类研究长期以来一直是一个令人困扰的问题，一方面，兰科菌根真菌除少数能形成产孢结构或有性子实体外，多数处于不育的菌丝阶段

4、，缺乏稳定的形态学和培养特征，另一方面，有关兰科菌根真菌分类的资料也较少。对菌根真菌种类的了解、种的确定是研究兰科植物菌根的一个基本环节。80 年代后，国外在这方面有了一些较为出色的工作，但在我国，仅自天麻、细叶石斛和见血清中分离到几种菌根真菌。在兰花生活史中，成年兰是它们的主要生活阶段，也是兰科植物入药或作为观赏兰花的主要器官。因此，揭示成年兰根与菌根真菌之间的内在关系将为自然条件下兰科植物的栽培提供重要的理论依据，也是真正保护野生兰花资源的关键所在。目前仅有少量有关成年兰菌根显微结构的报道，缺乏更深入的研究。1 1 兰科植物菌根的特点兰科植物菌根的特点兰科植物，无论绿叶兰还是非绿叶兰，在其

5、生活史中必须部分或完全依靠菌根真菌为其提供营养才能生存。兰科植物种子细小，其原胚不具备能使种子发芽并发育形成原球茎和幼苗所需的养分，因此，萌芽的种子必须从它处获得营养，特别是碳水化合物，才能生长发育。腐生兰没有叶绿素，是异养植物，完全依赖真菌为其提供养分完成其生活史。所以兰科植物在种子萌发阶段或在不能进行光合作用自养的时期，必须与菌根真菌共生，获得碳水化合物和其它营养物质。一系列有关兰科植物菌根的研究表明，兰科植物自其共生真菌获得营养，而真菌作为异养性微生物，其碳源取自其它活的有机体或死的残留有机物上，而非其“寄主”兰科植物。所以兰科植物的菌根真菌往往又与附近的其它树木、树桩或土壤内的残留有机

6、物相连。目前已经发现有的真菌在与兰科植物形成内生菌根的同时，与其它植物形成外生菌根，三者间似乎存在某种三重共生平衡关系。尽管在自然界几乎所有的兰科植物都有菌根，但菌根只形成在兰科植物的营养根上（当年形成的新根），而在贮藏根（根茎）上却没有菌根真菌侵染，气生根上也很少有菌根真菌存在。Gaumann(19561961)，Burges(1939)Nuesch(1963)和 Arditti(1975)等的一系列研究证明兰科植物活的贮藏根可产生一种杀真菌物质兰酚(orchinol)(Harley&Smith1983)，从而抵抗真菌对它们的侵染。兰科植物菌根常呈污白色、浅黄色或浅黄褐色，表面有松散的外生菌

7、丝与其它树木或残余有机物相连。菌丝具隔膜，在营养根或原球茎的皮层组织细胞内形成结状或螺旋状的菌丝圈菌丝结(Peloton)。不形成菌套和哈蒂氏网，是一种内生菌根。2 2 形成兰科植物菌根的真菌形成兰科植物菌根的真菌早在1840年，Link首先证实在兰科植物根内具有内生真菌。1846年，Reissek指出在雀巢兰 Neottia nidusavis Rich 等四种兰花的根中发现分布有真菌(Arditti，1967)，并被随之而来的大量工作证实，其中以Wahrlich(1886)的工作最为突出，他对来自世界各地的 500 种兰花的根进行了研究。法国的 NoelBernard(1899)在林中发现

8、了大量 Neottia L.的幼苗，并注意到它们均被真菌侵染，从而推断真菌的侵染是种子萌发所必须的，并建立了种子与真菌的共生萌发实验证实了这一假设。至此，真正揭开了兰科菌根之谜，有关菌根真菌的种类和真菌对种子、幼苗和成熟植物作用的研究得到广泛开展(Burgeff，1932，1959；Downie，1940，1943a，b，1959a，b；Curtis，1936，1939，1943；Knudson，1922；Arditti，1967)，发现大量的兰根分离物均隶属于半知菌形式属丝核菌属(Rhiozoctonia)(Burgeff，1936)，包括 R.repens，R.goodyerae-repe

9、ntis 和R.solani(Arditti，1967)。Catoni(1929)从 Cypripedium sp.分离到的一个丝核菌菌株产生了有性世代，被鉴定为 Corticium catonii.另外还发现 Xerotusjavanicus 可与 Gastrodia spp。形成菌根，Marasmius coniatus 与 Didmoplexis、Armillaria mellea 与 Galeola septentrionalis 及 Gastrodia elata 也可形成菌根(Harley，1959)。Warcup 和 Talbot(Warcup&Talbot，1962 一 198

10、0；Warcup，1982，1985，1988，1991)从澳大利亚兰根中分离到大量属于丝核菌属的菌株，经培养形成了有性世代，鉴定后发现分别属于 Thanatephorus(Corticium)，Ceratobasidium，Ypsilonidium，Sebacina 和 Tulasnella。Warcup(1975)和Jonsson&Nvlund(1979)发现有些绿叶兰的种子可与 Oliveonia pauxilla 和Favolaschia dybowskyana 共生而萌发，而这两种菌都没有丝核菌阶段。大量具锁状连合的担子菌也自非绿叶兰中获得，因而一度认为兰根中的内生真菌可能都是担子菌

11、，现已证实并非如此。在这些分离物中有些形成了子实体，分别为 Marasmius coniatus，Xerotus javanicus，Hymenochate sp.Armillaria mellea和 Fomes sp.(Kusano,1911；Burgeff,1932,1936；Hamada,1940；Hamada&Nakamura,1963)。Warcup(1981)用 65 种木材腐朽真菌对一种无叶绿素的蔓生兰科植物 Galeola foliata 的种进行接种试验，结果有 7 种白腐菌(如：彩绒革盖菌 Coriolus versicolor)和 2 种层孔菌(Fomes sp.)能同种

12、子共生，促进种子发芽(Harley&Smith,1983)，至此，有关兰科内生真菌的分离和分类的研究除少数无丝核菌阶段的担子菌外，多数都是有关丝核菌菌株或至少部分特征是属于丝核菌的菌株在不同兰花或同种兰花根中的再次发现(Alexander&Hadley,1983;Harvais,1973;Harvais&Hadley,1967;Hadley&Williamson,1972;Nishikawa&Ui,1976)。对常规分离兰科内生真菌时所获得的隶属于丝抱纲(Hyphomycetes)的不育菌丝群(Mycelium radicisatrovirens(MRA)(Melin，1922)的多种真菌未给

13、予注意。1985 年后，加拿大学者 R.S.Currah 及其研究小组对北温带的陆生兰花的内生真菌作了一系列的研究，发表了 15 个种，其中 5 个新种，l 个新组合，分别隶属于 Rhizoctonia，Phialocephala，Leptodontidium，Trichocladium，Trichosporiella，Epulorhiza，Ceratorhiza，Sebacina，Sistotrema，Moniliopsis，Thanatephorus和 Ceratobasidium(Currah et al,1987a，b，1988，1990)，首次对生于兰根中的 MRA 类真菌作 T 研

14、究(如 Phialocephala，Leptodontidium 等)，并对每个种的培养和形态特征作了详细描述，为今后的研究工作提供了较准确而详实的资料。Moore(1987)将菌丝隔膜的特征与真菌分类相联系，根据隔膜的形态结构和菌丝细胞内细胞核的数目，对原包括在丝核菌属中的那些形态学上明显有区别的真菌进行研究并建立了 3 个新属：Ceratorhiza，Epulorhiza 和 Moniliopsis，各新属相应的有性世代分别为 Ceratobasidium；Tulasnella 和 Sebacina；Thanatephorus。而丝核菌属则保留下来用来包括该属的模式种R.crocorum(

15、Pers.)DC:Fr。这一分类体系使我们对丝核菌类真菌的认识更全面，进行分类鉴定时更准确、方便。Currah et al(1992a，b)也研究了菌丝隔膜与兰科内生真菌分类的关系，证实以菌丝隔膜结构与细胞内核的数目为分类特征划分的类群与利用培养特征和菌丝显微结构为分类依据划分的类群是一致的，承认了Moore(1987)的 3 个新属，列出了兰科菌根内生真菌的最基本的检索表，记载了迄今已发现的兰科内生真菌 15 个属，29 种和 2 个腐生类群，并附有主要的培养特征和形态结构特征的描述，为兰科菌根内生真菌的种类研究提供了较可靠的依据和有效的手段。在欧洲(Marchisio et al,1985

16、;Salmia,1988)和亚洲部分地区(Tsutsui&Tomita,1986;Uetake et al,1992;Masuhara etal,1991;Terashita,1982;Hadley,1985)也有有关兰科菌根内生真菌的大量工作，但多未涉及到内生真菌的分类研究。有关热带附生兰花菌根真菌的工作也很多(Hadley&Williamson,1972;Bermudes&Benzing,1989;Benzing,1981;Goh et al,1992)，但仅 Hadley&Williamson(1972)对内生真菌种类作了研究，并鉴定出Ceratobasidium cornigerum(

17、Bourdier)Rogers，Tulasnellacalospora(Bourdier)Juel 及几个丝核菌菌株。Richardson(1993，1995)对哥斯达黎加的 59 种热带附生兰花菌根内生真菌的研究是较为杰出的。他发现有 23个种的根中有菌丝结，从 5 个种中分离到 T 属于担子菌的内生真菌，分别是Ceratorhiza，Moniliopsis 和 Melanotus(Agaricales)，其中 Melanotus 是首次报道。其余的分离物属于子囊菌(Ascomycotina)和半知菌丝抱纲。子囊菌有Calonectria，Chaetomium，Eupenicillium，G

18、lomerella，Hypoxyon，Leptosphaerulina，Nectria，Pseudollescheria，Xylaria 等 9 属；半知菌有Acremonium，Acrogenospora，Atlernaria，Arthrinium，Chloridium，Cladosporium，Codinaea，Curvularia，Dactylaria，Drechslera，Epicocchum，Fusarium，Geotrichopsis，Gliocladium，Hadrotrichum，Humicola，Malbranchea，Monilia，Nodulisporium，Perico

19、niella，Pithomyces，Ramichloridium，Seytalidium，Stilbella，Tetracladium，TroPosporella，Verticillium，Myceliasterilia group A，Mycelia sterilia group B等 28 属及 2 个不育菌丝组，附有各属种的描述，但没有探讨它们在种子萌发中的作用。“兰科丝核菌类”及其他的兰科内生真菌的鉴定是非常困难的，一方面真菌本身缺乏稳定的形态学和培养特征，另一方面可靠的文献也很少。Andersen(1996)从形态学、超微结构和分子水平对 40 个隶属于丝核菌(Rhizoctonia

20、 sensu lato)的菌株(包括相应的有性世代和大量未鉴定的兰科内生真菌)的分类作了比较研究。证实了 Moore(1987)对丝核菌属的重新划分。并指出 Epulorhiza 的有性世代应限制在 Tulasnella 中，因为 Sebacina 菌株的菌丝隔膜孔的超微结构显著不同于 Epulorhiaz。Ceratorhiza 的菌株在菌株形态、隔膜孔超微结构及 RFLPs图谱三方面与 Moniliopsis 难以区别，二者的区别仅限于核的数目的不同。Moniliopsis 的有性世代限制在 Thanatephorus 中。Mordue et al(1989)，曾从培养特征、生化技术、菌株

21、融合组等角度探讨了丝核菌类的分类，认为兰根中分离出的 Thanatephorus pennatus，Rhizoctonia repens 是独立的种。我国对兰科菌根真菌的分类研究仅见徐锦堂等(1989)分离自天麻原球茎的紫箕小菇 Mycena osmundicola 和郭顺星(1991)自细叶石斛和见血清原球茎中分别分离到的微囊菌属(Microascus Zukal)和毛壳菌属(Chaetomium Kunze etSchmidt)的 2 个未定种菌株，但上述 3 个菌株(种)均可促进其“寄主”兰科植物的种子萌发。3 3 兰科植物菌根的形成兰科植物菌根的形成在大多数兰科植物的生活史中，菌根的形

22、成分为两个阶段：第一个阶段是萌发幼苗的初次感染，是原球茎与共生真菌的相互作用时期。第二个阶段是成年兰新根(营养根)的再次感染，是成年兰根与真菌相互作用的时期。3.1 原球茎与共生真菌的相互作用自然状态下，兰科植物种子萌发时，必须与适当的菌根真菌共生，才能发育形成原球茎和幼苗。兰科植物种子非常细小，结构简单，仅由种皮及未分化的胚组成，无胚乳。通常在 1 个茹果中就含有成千上万个轻如尘埃的微粒种子。最大的种子平均千粒重不到 10 毫克，最小的种子千粒重不到1 毫克。天麻(Gastrodia elata)种子呈纺锤形至新月形，平均长 670 微米，宽 120 微米，种皮由一层无色透明的长形薄壁细胞组

23、成，侧壁木质化加厚，种胚居种子中部。种子成熟时胚处于原胚阶段，椭圆形，平均长180 微米，宽100 微米，由数十个原胚细胞和分生细胞组成，大略可分为 57 层。胚前端为分生组织，中间为原胚细胞，基部一个基细胞呈倒，三角形，为柄状细胞，柄状细胞外包有一层形似胶状的非细胞结构物质，PAS 染色阳性(徐锦堂，1980a，b，1993)。共生萌发是指当兰科植物种子与适当的真菌相遇时，二者形成共生关系，种子萌发形成原球茎并发育成幼苗的过程。自 Benard(1904，1909)首次发现了兰科植物需依赖真菌的侵染才能生长发育，建立了种子的共生萌发实验方法，并指出可溶性的有机化合物至少可部分替代真菌的作用后

24、，有关种子萌发的研究广泛地开展起来。Knudson(1922，1924)在本世纪 20 年代的一系列研究成功地在含糖培养基上培养出了兰花幼苗，建立了一套兰科植物种子的非共生萌发(无共生真菌存在，以有机化合物为碳源)实验方法和萌发所需的恰当的培养基配方，为利用非绿叶兰 幼苗的发生研究兰花种子萌发时对营养的要求，揭示菌根真菌在兰花幼苗发生过程中的作用提供了有效的手段，同时也为利用种子栽培兰花提供了一套可靠而简便的方法。目前已有大量的兰花种子通过该方法萌发成功，有的甚至可以开花(Harley，1959)，但在自然状态下，真菌的存在却是种子萌发形成原球茎及幼苗的必须条件(Burgeff，1936；19

25、59)。实验室条件下对兰花原球茎与真菌共生物之间的共生关系的形成和结构特征的研究仅涉及到少数兰花的种，也很少涉及除丝核菌属真菌以外的其它兰科菌根真菌。Burgeff(1959)总结了早期原球茎真菌相互作用的观察，但最详细的有关这种关系的结构特征的论述是被丝核菌属的种定殖的 Dactylorhiza purpurella(CT.&T.A.Steph)Soo 的原球茎(Hadley et al 1971；Hadley，1975，1982；Strullu&Gourret，1975)以及被Ceratobasidium cornigerum(Bourdot)Rogers 定殖的 Pterostylis

26、cucullataR.Br.的原球茎(Clements，1988)。以后，Peterson&Currah(1990)对 Goodyerarepens 与 Ceratobasidium cereale、Rasmussen(1990)对 Dactylorhiza majalis与 Epulorhizasp。、Uetakeetal(2992)对 Spiranthessinensis 与 Rhizoctonia sp.以及 Richardson(1992)对 Platanthera hyperborea 与 Rhizoctonia cerealis或 Ceratorhiza goodyerae 一 r

27、epentis 之 I 司的共生关系的形成和结构特征的变化也进行了详细的研究。郭顺星(1990a，1991)研究了产于我国的白友、细叶石解、铁皮石解等的种子萌发及原球茎发育过程中与菌根真菌的互作。但上述工作多集中在陆生兰(地生兰)或少数附生兰中，对于腐生兰花的研究较少，仅有产于西澳大利亚的地下生腐生兰 Rhizanthella gardneri 受到较多的关注。Dixonet al(1990)对该兰花的分布、生态习性、形态结构以及与其共生的菌根真菌间的关系等作了概括性论述。Rhizanthella gardneri 的菌根真菌是丝核菌属的 2个菌株，其有性世代是 Thanatephorus(W

28、arcup，1981，1985；Hadley，1982)。其中一个菌株产生的有性世代被鉴定为 Thanatephorus gardneriWarcup(Warcup，1991)。该菌根真菌既可促进其“寄主”兰花的种子萌发，又可存在于地下生的块茎中为植物提供营养。对于腐生兰天麻的研究，近年来在我国有很大的进展和突破。徐锦堂(1980，1981)成功地从天麻种子发芽后形成的原球茎中分离并筛选出十余个对天麻种子萌发有较好促进效果的菌株，其中一株形成了子实体，鉴定为紫箕小菇(Mycena osmundicola Lange)(徐锦堂等，1989)。证明了与天麻块茎共生的菌根真菌蜜环菌(Armilari

29、a mellea)抑制天麻种子萌发(冉砚珠等，1988)，首次阐明了天麻必须先后与两种不同的真菌共生才能完成其生活史。这说明，在兰科植物中，种子的萌发与成年兰的生长发育可能与同一种真菌共生，也可能与不同的真菌共生，这似乎能解释为什么在有些共生萌发实验中，种子的萌发是成功的，但幼苗的移栽及成年兰的生长却是失败的。也可部分地解释兰科植物与其菌根真菌之间的专一性的变化，因为迄今为止，专一性探讨均是建立在自成年兰根中分离到的菌根真菌与该“寄主”兰花种子之间的共生关系能否建立的基础上。如果兰花在种子萌发与成年兰阶段需与不同的真菌共生，那么仅据种子的共生萌发试验来评价兰科植物与真菌间的专一性显然是不充分的

30、。因此，进一步研究其它兰科植物中是否也存在类似现象是很有必要的。兰科植物种子的萌发始于种皮的破裂。在某些兰花中(如 Cypripedium)，真菌首先突破种皮自胚柄端细胞进入胚中，然后在胚细胞内扩散，胚细胞膨大，使种皮破裂。而在其它的属如 Phalaenopsis 和 cattelya 中，种子吸水膨胀，种皮破裂，然后真菌自胚柄端细胞侵入胚中(Jackson&Mason，1984)。有时菌丝也自根毛或胚柄细胞附近的表皮细胞侵入胚中(Hadley&williamson，1971；Purves&Hadley，1975)。当真菌菌丝穿过胚的细胞壁时，原球茎细胞的质膜内陷，真菌菌丝被其包围，植物细胞生

31、理活性增强，出现大量的线粒体、内质网、高尔基体和各种大小的液泡，淀粉粒也开始形成，核明显的膨大(Burgeff，1932)。利用显微光密度计和放射性自显影技术，Williamson&Hadley(1969)测定了Dactylorchis purpurella 和 Spathiglottis plicata 与 Tulasnella calospora共生时植物细胞内核的变化，发现核总是比不与真菌共生时大。侵入胚中的菌丝从一个细胞向另一个细胞侵染，原球茎基部的 23 层细胞往往被菌丝充满，菌丝在植物细胞中生长并形成菌丝结，增大了两共生物之间的接触界面。定殖于Dactylorchis purpur

32、ella 皮层细胞中的菌丝的细胞壁分为二层，内层电子致密，较薄，与其自身质膜相邻，外层厚度度化较大，电子密度相对低些(Strullu&Gourret，1974)。Hadley et al(1971)也描述 7 类似的现象，并指出外层细胞壁呈颗粒状。Strullu(1978)认为外层壁可能完全或部分是由于原球茎的作用产生的。Nieuwdrop(1972)进一步指出环绕菌丝的原球茎细胞质膜合成了这层壁的各种成分(果胶和纤维素)，而幼龄的菌丝和菌丝结可消化它们。Hadley(1975)进一步指出菌丝外层壁的形成是真菌与植物相互作用的产物，因为他认为菌丝本身的外层电子透明的壁完全不同于当它们存在于原球

33、茎细胞内时的加厚、颗粒状的外层壁。刚刚侵入原球茎细胞中的真菌菌丝具有丰富的原生质，内含细胞核、液泡、线粒体、脂肪滴和糖原颗粒，无内质网(Strullu&Gourret，1974)。Hadley 及其同事(1971，1975)观察到真菌的原生质膜也部分内陷形成泡囊状结构，推测这可能与共生体双方的物质转运有关。还注意到真菌细胞的内层壁常在外层壁中形成突起，而与之相对的原球茎细胞质膜则在此处凹陷，可能也与物质转运有关。原球茎细胞内的菌丝结的寿命并不长，通常不过几天最多十几天就被消化了。Strullu&Gourret(1974)将菌丝自侵入到菌丝结被消化这一时期分为四个阶段:阶段一，指菌丝刚刚侵入原球

34、茎细胞(如上描述)；阶段二，菌丝仍被原球茎细胞质膜单独环绕，菌丝扁化，外层细胞壁更厚，原生质已消失，仅剩一些质膜和颗粒状物质在缓慢分解；阶段三，菌丝结已完全衰败，菌丝内含物已完全消失，仅剩一团细胞壁被原球茎细胞质膜包围；阶段四，菌丝的形状已完全失去，细胞壁也已解体。此时，该原球茎细胞可被新菌丝重新定殖，形成新的胞内菌丝团。Uetake(1992)在研究 Spiranthessinensis 的原球茎与双核的 RhizoctoniaAG 一C 的共生关系时，据原球茎宽度的变化将上述从菌丝侵染到被完全消化的过程划分为七个阶段，从原球茎细胞的结构和物质变化及菌丝的消化两方面探讨了两者之间的相互作用过

35、程。有关植物细胞内菌丝被消化而衰败的原因迄今了解甚少，一直遵循早期 Bernard 的观点，认为是由于兰科植物的细胞活动引起的，可能是兰科植物对真菌侵染的一种防御反应，也可能是植物引导真菌释放营养的一种手段。williamson(1973)曾指出，当真菌菌丝衰败现象发生时，酸性磷酸酶的活性增加。刘成运(1982a，b，1983)和王贺(1992，1993a，b)对天麻发育过程中的酸性磷酸酶的分布和作用进行了研究，发现酸性磷酸酶主要分布在植物的消化细胞内，这些细胞可主动产生大量含酶颗粒将侵入的菌丝包围，并相互融合形成包围菌丝的消化泡将菌丝消化，显然酸性磷酸酶确与菌丝的消化密切相关。Uetake

36、etal(1996)对Spiranthes sinensis共生原球茎中腺昔酸环化酶的研究表明该酶与菌丝消化无关。Richardson et al(1992)在定殖于 Plantanthera hyperborea 原球茎的菌丝中观察到磷以多聚磷酸体 Poly 一 P 的形式贮存在细胞中，这是 Poly 一 P 在定殖于兰科原球茎的菌丝中的首次发现。Chivers et al(1985)曾在添加有磷的培养基上培养的 2 株兰科菌根真菌的菌丝中观察到 Poly 一 P 的存在。由此看来，利用这一特点，通过改变兰花真菌共生体生长的培养基中的磷的浓度，就有可能确定植物细胞内菌丝对磷的富集能力，探讨在

37、菌丝降解以前，其内部富集的磷是否已被利用。在某些培养条件，菌根真菌在原球茎上可变成寄生性的，最终导致这种共生结构的解体。到目前为止，有关原球茎与真菌之间的关系已在实验室研究中获得了大量的资料，尚待进一步研究的问题主要有:当真菌侵染兰科植物时，胚和原球茎是否能产生一些将菌丝吸引向它的化能营养物质尚无证据(Williamson&Hadley，1970)，也没有有关真菌与胚和原球茎最初相互接触的资料。关于菌丝侵入胚时的侵入位点也有一些变化。在几个种中，如 pterostylis cucullata，Goodyerarepens 和 Platanthera hyperborea，菌丝主要自胚柄端侵入胚

38、中(Clements，1988；Peterson&Currah，1990；Richardson et al，1992)，而在其他种中，如 Dactylorhiza majalis，菌丝主要自表皮毛(根毛)侵入胚中(Williamson&Hadley，1970；Rasmussen，1990)。前者涉及到菌丝在死细胞内的生长(Rasmussen，1990；Riehardson et al，1992)，因为在兰科种子中胚柄端细胞常部分由死细胞组成或有退化的胚柄细胞残迹。Rusmussen(1990)发现在 Daetylorhizamaialis(Rehb.f.)Hunt&Summerh 中，菌丝确实

39、可侵人胚柄端细胞，但并不进一步发育形成菌丝结，而这些胚柄端细胞则充满了丹宁类物质。这种现象在其它兰科植物中还没有观察到。菌丝进入发育中的原球茎后，薄壁细胞被真菌定殖，菌丝交织成环状，形成菌丝结。这些菌丝被细胞质膜和一些未知的基质状中间界面物质包围，而与原球茎的细胞质隔离开来，营养物质的交换可能发生在这个界面上或这些菌丝的细胞壁和菌丝的质膜上，但还有待实验结果来证实。菌丝结在寄主细胞中形成不久后即被消化。但正如前文提到的那样，消化的机制知之甚少。Peterson&Currah(1990)发现了在 Goodyera repens 的原球茎细胞中，衰败的菌丝团块被棉兰正反应物质包围，它们可使原球茎细

40、胞中该区域的水解酶区域化，利于菌丝的消化。相信细胞化学方面的研究将有助于该问题的解决。3.2 成年兰根与共生真菌的相互作用幼嫩的原球茎是真菌侵染的第一个器官，但随着原球茎的进一步分化，幼根形成，真菌并不直接向幼根侵染，幼根内的真菌总是来源于它周围的土壤中(Harley，1959)。大多数兰科植物的根分为贮藏根和营养根，贮藏根可产生兰酚一种杀真菌剂，真菌不能侵入，因而只有营养根能被真菌侵染，形成菌根。对于以块茎越冬的多年生兰科植物，在每年休眠后都要发出新的营养根，这些新根也必须与适当的真菌共生才能为植物提供营养。有关菌根真菌在兰根中的定殖过程的研究很少(Harley&Smith，1983)。在某

41、些种中，如 Calypso bulbosa，根毛可能是菌丝的侵入点(Burgeff，1959；Currahet al，1988)。此外，随着菌丝在根表面的不断出现，表皮细胞可能被菌丝直接穿过(Burgeff，1959)。Aclonero(1969)曾在 Vanilla 的种中，观察到菌丝直接穿过表皮细胞，然后进入两型的外皮层细胞的短细胞内。在 Spathoglottisplicata BI，Calanthe pulchra(BI.)Lindl.和 Arundinggraminiflia(Don.)Hochr。中，根毛常与被真菌定殖并延长了的皮层细胞相邻，且变得扭曲、变形，但没有描述这些根毛是否

42、也被菌丝定殖(Hadley&Williamson，1972)。如同在原球茎中一样，真菌的菌丝在兰根的皮层细胞中也可形成菌丝结。菌丝的消化有两种方式，一是菌丝结的吸收，即菌丝在根的皮层细胞内被消化掉；二是胞质逸出，进入皮层细胞内的菌丝顶端膨大、变形，破裂形成小的消化体(Harley，1959)。徐锦堂(1990)对腐生兰天麻的块茎与其共生真菌蜜环菌的相互作用作了详细的论述，发现蜜环菌只能侵染各块茎形成的营养繁殖茎和越冬后的米麻、白麻，不能侵染当年的新生麻，因新生麻内产生水溶性的抗真菌蛋白。白麻及其分化生长的营养繁殖茎的表皮、皮层及大型细胞层是蜜环菌的侵染区域。当蜜环菌菌索与天麻接触后，菌索皮层细

43、胞开始分裂，长出分枝，对天麻块茎产生强大的机械压力(也可能有菌丝产生的酶的作用)，菌索内的菌丝活化，直接穿过天麻块茎的表皮细胞侵入，菌索突破天麻表皮和皮层细胞，进入皮层最内一层细胞，称为易染菌层，向内为大型细胞层。菌索破坏易染菌层的细胞壁和其他结构，形成菌丝通道，菌索皮层逐渐溶解，失去菌索的完整形态，在菌丝通道内形成具明显方向性的菌丝流，这层细胞也被称为菌丝流细胞层。这些菌丝则通过细胞壁的纹孔向大型细胞层侵染，并在大型细胞中形成菌丝结，进一步被消化。易染菌层内的蜜环菌以侵染为主，菌丝在这一时期仅形成少量稀疏菌丝结，自溶或部分被消化成为天麻的营养。易染菌层细胞的原生质、细胞核等被侵入的蜜环菌消化

44、，有些细胞成为空腔，此时蜜环菌的营养除来源于菌枝、菌材外，还部分取之于天麻块茎细胞内物质。大型细胞以消化蜜环菌为主，在这层细胞中的蜜环菌均被大型细胞消化，其消化过程类似于天麻原球茎细胞消化紫箕子菇，也基本与其它兰科植物中观察到的一致(徐锦堂，1993)，但没有观察到由大量衰败菌丝细胞壁折叠形成的衰败菌丝团块。成年兰菌根结构的研究表明，菌根真菌主要分布于兰根的皮层细胞。根据各部分功能的不同将皮层细胞分为三层:真菌寄主细胞层，消化真菌的细胞层，贮藏营养层。但从未观察到天麻块茎中出现的菌丝流细胞层。在多年生兰科植物中，每个生长季节的开始都需要形成新的营养根及新的菌根，为植物提供营养。因此，成年兰菌根

45、形成的季节性变化一直受到广泛的研究。在一个生长季节中，除了根尖部分，营养根皮层细胞内一直重复着菌丝侵入和被消化的过程，植物也随之生长、开花、结实，到了生长季节的末期，根内菌丝结活力逐渐下降，根也随之死亡(Harley，1959；Harvais&Hadley，1967；Masuharaet al，1955；Currah et al，2959)。成年兰贮藏根，作为陆生兰花的典型贮藏器官，产生兰酚抑制并抵抗菌根真菌的侵染已被大量的工作证实，但 Masuhara etal(1992)在研究兰科植物 Spiranthes sinense var.amoena 的贮藏根时发现，随着贮藏根的生长，根内的菌丝

46、结呈增加的趋势，老的贮藏根中有许多淡黄色的死的菌丝结，在近表面处还可观察到真菌的侵染，可见，菌根真菌在贮藏根内也可进行有限的扩展，真菌也很容易被消化，但真菌的重复侵染源始终只来自外界环境。在日本的其它兰花的贮藏根中，如 Ponerorehis graminifolia，p.kurokamiana 和 Amitostigma keiskei 等，从未观察到菌丝结分布，而 S.Sinesvar.amoena 贮藏根中菌根真菌的侵染也绝不象营养根中那样经常，菌丝结的数量也少得多。因此，他们认为，在这一点上，S.Sines var.amoena 可能是营养根与典型贮藏根之间的中间类型。Masuhara

47、 还进一步提出，这种营养根与贮藏根之间菌丝结分布的差异可用于对这两种根的鉴别，因为，事实上，该兰花种的这两种根在外形上是很难区别的。这种方法可能也适合于其它有类似特点的兰花。腐生兰在成年兰阶段对真菌的依赖是毫无疑问的。那么绿叶兰呢，它们可进行光合自养，是否也需要菌根真菌为其提供营养?试验证明，在绿叶兰中存在两种情况，一是完全自养，二是形成菌根，利用真菌提供的部分营养，但在种子萌发阶段，二者都离不开菌根真菌(Harley，1959)。在完全自养的兰花种中，有发育良好的根，根内有发达的维管束系统为其输送养分，绿色叶片宽而大，具有典型的自养植物特征，如 Listera 和 Epipaetisspp.

48、(Harley&Smith，1983)。形成菌根的绿叶兰，常具小而窄的叶片，叶绿素少或缺乏，它们对真菌的依赖程度常因环境条件而改变，外界条件利于光合自养时，菌根真菌的侵染减少，反之，真菌的侵染增加(Harley，1959)。但无论怎样，这类兰花都要部分地依赖真菌，菌根真菌的存在，有助于兰花的生长。用14C 试验已经查明，即使兰科植物已经长出了绿叶，能独立光合自养，14C 仍是从真菌向兰科植物转移，显然，这时的兰科植物仍需要菌根真菌为其补充一部分碳水化合物。只有当含有14C 的兰科植物死去时，14C 才由植物向菌丝方向大量转移，这时的菌根真菌对死的兰科植物开始营腐生生活。3.3 天麻原球茎与紫笑

49、子菇共生关系研究天麻是兰科中的异养型植物、其生长所需的营养由与之共生的蜜环菌提供(Kusano，1911；张维经，1980)，种子萌发形成原球茎则需要与紫箕小菇共生才能实现(徐锦堂，1989，1990)。紫箕小菇自天麻种子胚柄端细胞侵入胚后，继续侵入第 2、第 3 层原胚细胞。此时的原胚细胞，细胞核增大，细胞质变浓，在细胞核周围出现深染物质，液泡也稍有增大。多糖颗粒减少，而邻近的未染菌的其它原胚细胞，多糖颗粒大且增多。紫箕小菇菌丝继续侵入上一层原胚细胞，原染菌细胞的细胞核崩解消失。菌丝被细胞质包围壁加厚，或被细胞质形成的囊状体包围，形态变粗的菌丝形成菌丝结，含有菌丝结的细胞称为菌丝结细胞。胚柄

50、细胞端第 4 或第 5 层中央的原胚细胞分化成大型细胞，菌丝自菌丝结细胞侵入大型细胞，被大液泡包性围最终消化。菌丝在原球茎细胞中的消化过程有以下几种变化：(1)刚刚侵入皮层细胞的菌丝具完整的菌丝形态和结构；(2)菌丝被胚细胞产生的囊状体消化而处于脱壁状态，脱下的细胞壁可附着在囊状体一侧或周围，也可游离存在被进一步消化；(3)有的菌丝无上述脱壁现象，在被消化前，其细胞质就逐渐消失变为空腔，这是一种菌丝失去活性即将崩解的表现，最终被胚细胞彻底消化；(4)同未侵染天麻种胚的正常的紫箕小菇相比，存在于胚细胞中的，有些菌丝内外壁被消化掉，仅剩质膜包围的细胞质团，但其细胞质组成无大的改变，有细胞核、内质网