PMSF及常用试剂的配制方法.pdf

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1、 PMSF 及常用试剂的配制方法 Revised by Liu Jing on January 12,2021 PMSF 英文全称：Phenylmethanesulfonyl fluoride 中文名称：苯甲基磺酰氟 分子式：C7H7FO2S 分子量：CAS 号：329-98-6 PubChem 号：4784 结构示意图：分类：Organic Chemicals Sulfur Compounds Sulfones Phenylmethylsulfonyl Fluoride 使用介绍：1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml 溶于异

2、丙醇（或无水乙醇）中；3）在室温可保存一年,一般保存在-20 度或 4 度.；4）工作浓度：17174ug/ml（1mM），储存液浓度为 100 或 200mM；5）在水液体溶液中不稳定，30 分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的 PMSF，样品处理超过 1h,补加一次。（见水分解，使用前加入）【注意事项】1.PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF 污染的衣物应予丢弃。2.PMSF 在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存

3、液中现用现加于裂解缓冲液中。3.PMSF 在水溶液中的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快，且 25的失活速率高于 4。pH 值为时，20mmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min，这表明将PMSF 溶液调节 为碱性（pH）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。PMSF 的储存：2-8可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-20 例:100mM PMSF 称量 PMSF(针状结晶固体)溶于 10ml 异丙醇,震荡混匀，保存在-20 度或度.工作浓度我一般用 1mM,1:100(V/V)加入即可.样品处理超过 1h,补加一次.(PMSF 剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性

4、手套操作PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。）PMSF 在水溶液中的活性丧失速率随 pH 值的升高而加快，且 25的失活速率高于4。pH 值为时，20mmol/l PMSF 水溶液的半寿期大约为 85min，这表明将PMSF 溶液调节 为碱性（pH）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。用异丙醇溶解 PMSF 成 ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20。如有必要可配成浓度高达 ml 的贮存液（100mmol/L）。常用试剂的配制：1、30%丙烯酰胺 (1)配制方法：将 29G 丙烯酰胺

5、和 1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml的水中，加热至 37溶解之，补加水至终体积为 100ml，用 Nalgene 滤器（孔径）过滤除菌，查证该溶液的 pH 值应不大于，置之不理棕色瓶中保存于室温。（2）说明：小心丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具螺积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约体积的单床混合树脂（MB-1 Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1 号滤纸以纯化之。

6、在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸。2、10%过滤酸铵 （1）配制方法：把 1g 过硫酸铵溶解于终量为 10ml 的水溶液中，该溶液可在4 保存数周。3、1mol/L 氯化钙 （1）配制方法：在 20ml 纯水中（Milli-Ce 水或相当级别的水）溶解 54g Cacl2 6H2O 用滤器过滤除菌，分装成 10ml 小份贮存于-20。（2）说明：制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用纯水稀释至 100ml，用Nalgene 滤器（孔径）过滤除菌，然后聚冷至 0。4、1mol/L 二硫苏糖醇（DTT）（1）配制方法：用 20ml L 乙酸钠溶液（）溶解 DTT，过滤除菌

7、后分装成 1ml小份贮存于-20。（2）说明：DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理。5、L EDTA（）（1）配制方法：在 800ml 水中加入=水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液的 pH 值至（约需 20g Naoh 颗粒）然后定容至 1L，分装后高压灭菌备用。（2）说明：EDTA 二钠盐需加入 NaoH 将溶液的 pH 值调至接近时，才能完全溶解。回到页首 6、10mg/ml 溴化乙锭 （1）配制方法：在 100ml 水中加入 1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容光焕发器或转移至棕色瓶中，保存

8、于室温。（2）说明：小心：溴化乙锭 是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。这些溶液使用后应按附录 E 提供的方法之一进行净化处理。7、100mmol/L IPTG 配制方法：IPTG 为异丙基硫式-D-半乳糖苷（分子量为），在 8ml 蒸馏水中溶解 2g IPTG 后，用蒸馏水定容至 10ml，用滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于-20。8、1mol/L 硫酸酶 （1）配制方法：在 800ml 水中溶解四水乙酸镁，用水定容至 1L，过滤杀菌。9、巯基乙醇（BME）（1）配制方法：一般得到的是 L 溶液，应装在棕色瓶中保存于 4；（2）说明：BM

9、E 或含有 BME 的溶液不能高压处理 10、酚/氯仿 （1）配制方法：一般得到的是 L Tris Cl（）抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的 L TrisCl（）液层，保存于 4。（2）说明：小心，酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的皮肤部位应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。11、10mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）（1）配制方法：用异丙醇溶解 PMSF 成 ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20，如有必要可配成浓度高达 ml 的贮存液（100mmol/L）。（2）说

10、明：小心：PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触 3PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF 污染的衣服应予丢弃。PMSF 在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。PMSF 在水溶液中的活性丧失速率高于 4。pH 值为时，20umol/L 的 PMSF 溶液的半寿期大约为 35 分钟（James，1978），这表明将 PMSF溶液调节为碱性（pH）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。回到页首 12、磷酸盐缓冲溶液（PB S）（1）配制方法：在 800ml 蒸馏水中溶解 8g Nacl、Na2HPO4 和

11、KH2PO4，用HCL 调节溶液的 pH 值至加水定容至 IL，在 15 16f/in 2（10 5 Pa）高压下蒸汽灭菌 20 分钟，保存于室温。13、乙酸钾溶液（用于碱裂解）（1）配制方法：在 60ml 5mol/L 乙酸钾溶液中加入冰乙酸和水，即成钾浓度为3mol/L，而乙酸根浓度为 5mol/L 的溶液。14、3mol/L 乙酸钠 （1）配制方法：在 800ml 水中溶解三水乙酸钠，用冰乙酸调节 pH 值至或同稀乙烯调节 pH 值至，加水定容到 1L，分装后高压灭菌。15、5mol/L 氯化钠 （1）配制方法：在 800ml 水中溶解 Nacl 加水定容至 1L，分装后高压灭菌。16、

12、10%十二烷基硫酸钠（SDS）（1）配制方法：在 900ml 水中溶解 100g 电泳级 SDS，加热至 68 助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至，加水定容至 1L，分装备用。（2）说明：SDS 的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴口罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的 SDS，10%SDS 溶液无须灭菌。回到页首 17、20SSC （1）配制方法：在 800ml 水中溶解 Nacl 和柠檬酸钠，加入数滴 10mol/L Nach溶液调节 pH 值至加水定量至 1L，分装后高压灭菌。18、100%三氯乙酸 （1）配制方法：在装有 500g TCA 的瓶中加入 227ml 水，形

13、成的溶液含有 100%（W/V）TCA。19、1mol/L Tris （1）配制方法：在 800ml 水中溶解 Tris 碱，加入浓 HCL 调节 pH 值至所需值。pH HCL 70ml 60ml 42ml 应使溶液冷至室温后方可最后调定 pH 值，加水定容至 1L，分装后高压灭菌。（2）说明：如 1mol/L 溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的 Tris。尽管多种类型的电级均不能准确测量 Tris 溶液的 pH 值，但仍可向大多数厂商购得适合的电极。Tris 溶液的 pH 值因温度而异，温度每升高 1，pH 值大约降低.03个单位。例如：L 的溶液在 5、25和 37时的 pH 值分别为、和。20、Tris 缓冲液溶液 （1）配制方法：在 800ml 蒸馏水中溶解 8g Nacl、和 3g Tris 碱，加入酚红并用 Hcl 调 pH 值至，用蒸馏水定容至 1L，分装后在 15 1bf/in2（10 5 Pa)高压下蒸汽灭菌 20 分钟，于室温保存。21、X-gal （1）配制方法：X-gal 为 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有 X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20，X-gal 溶液无须过滤除菌。