免疫组化染色操作步骤.pdf

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1、.-免疫组织化学染色原理和操作步骤免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原一抗二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素生物素过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素过氧化物酶（SP）法。PAP 法一抗和二抗均不标记，避

2、免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成 PAP 复合物（含 3 个酶分子和 2 个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用 H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1 分子亲合素可结合 4 分子生物素，ABC 法即在此基础上建立。ABC 法与 PAP 法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成 ABC 复合物，

3、并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一-可修编.-抗和二抗后，再加入 ABC 复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入 DAB 进行显色。ABC 法的敏感性较 PAP 法更高。图 1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制组织学与胚胎学）SP 法与 ABC 法相似，其不同于 ABC 法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入 DAB 进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤，图 2.SP 法原理示意图同时也减

4、少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫 XX 染色技术。二、实验准备：二、实验准备：1.标本准备石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理冰冻组织切片：由病理室常规处理-可修编.-细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定 2 h。2.试剂准备抗体选择单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做 IHC 的抗体，抗体说明书上必须有 IHC 测试结

5、果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。二抗试剂盒目 前 本 实 验 室 所 用 二 抗 试 剂 盒 为LifeTechnologiesHistostain-Plus Kit(HRP,Broad Spectrum)，货号 85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB 试剂盒目前本实验室所用为加强型 DAB 显色试剂盒，货号 DAB-2032。其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES 胶3.抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须 Western blot 验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。4.耗材准备-可修编.-免疫组化笔或者蜡笔、盖

6、玻片、载玻片5.溶液配制磷酸盐缓冲液（PBS）10PBS 母液配制NaCl72 g37.3 g4.3gNa2HPO412H2OKH2PO4加蒸馏水至 1000 ml，充分混匀贮存。使用时用蒸馏水 10 倍稀释，调整 pH 值至 7.37.4。柠檬酸抗原修复液抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：称取柠檬酸 10.5 g，溶于 500 ml 蒸馏水；称取 Na2HPO412H2O57.3g，溶于 800 ml 蒸馏水。分别量取 358 ml 柠檬酸溶液和 642 mlNa2HPO4溶液，充分混匀后调整 pH 值至 6.0，即得 2母液，贮存备用。1%盐酸酒精浓盐酸与 75%酒精按照 1

7、:99 比例混合，充分混匀。三、免疫组化操作步骤三、免疫组化操作步骤1.组织片脱蜡水化将组织片依次放入 3 个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。-可修编.-依次放入 2 个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸 5 min。依次放入 2 个装有 95%乙醇的玻璃缸，每缸 5 min。依次放入 90乙醇、85乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸 2 min，取出。放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复 3 次。2.抗原修复将切片浸入 1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可注意：抗原修复过度或不

8、足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！致脱片，必须自然冷却！3.封闭内源性过氧化氢酶放入 3%H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡 15 min。放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复 3 次。放入 PBS 缓冲液的玻璃缸中，浸泡 5 min。4.抗体杂交甩去 PBS 余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清 1 滴20l（试剂盒中的 A 液，根据组织大小调整用量），28放置 20 min，甩干。加稀释好的一抗 1 滴（2050 l，根据组织块大小进行调整），置于湿盒 4过夜。置 PBS 缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗 5 min，更换 PBS 缓冲液，同法操作 4 次，甩干。-可修编.

9、-加入生物素偶联的二抗 2050 l（试剂盒中的 B 液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37放置 20 min。置 PBS 缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗 5 min，更换 PBS 缓冲液，同法操作 3 次，甩干。5.显色加链亲和素-辣根过氧化物酶 2050 l（试剂盒中的 C 液，根据组织块大小进行调整），湿盒内 28放置 520 min，甩干。置 PBS 缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗 5 min，更换 PBS 缓冲液，同法操作 3 次，甩干。滴加新鲜配制的 DAB 工作液 100l（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时（35 min），置装有自来水玻璃缸中涮洗 3次；6.

10、复染浸入苏木精溶液中复染，放置 5 min 后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用 1%盐酸酒精分化 12 s 后，自来水冲洗后，反蓝水洗 2 min。7.脱水、透明和封片依次放入 95、95乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出；依次放入 2 个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出。依次放入 2 个装有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出。滴加适量中性树胶，封片，晾干。8.8.注意事项注意事项-可修编.-整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。异性染色。组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液

11、、显色液等试剂要充分覆组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。盖组织块，避免干片。四、结果判定四、结果判定1.阳性细胞判断DAB 显色呈黄色。每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致，不能视为阳性。2.抗原表达评价免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，我们常用的免疫组化评分方法如下：细胞染色强度评分：0（无染色），1（弱染色），2（中染色），3（强染色）肿瘤细胞阳性率评分：0（09%），1（10%25%），2（26%50%），3（51%75%），4（76%100%）将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。-可修编.