微生物实验论文.pdf

《微生物实验论文.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物实验论文.pdf（8页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、微微 生生 物物 实实 验验 论论 文文功能微生物的筛选和选育功能微生物的筛选和选育本本 科科 生：生：指导教师：指导教师：培养单位：培养单位：学科专业：学科专业：完成时间：完成时间：I/8前言前言：微生物与我们的生活息息相关，在生产实践中起着重要的作用。比如一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一些微生物能够降解塑料、处理废水废气；另一些微生物能产生抗生素，被大量应用于生物制药领域微生物产业在21 世纪将呈现全新的局面。微生物从发现到现在短短的300 年间，特别是 20 世纪中叶，已在人类的生活和生产实践中得到广泛的应用，并形成了继动、植物两大生物产业后的第三大产业。

2、这是以微生物的代谢产物和菌体本身为生产对象的生物产业，所用的微生物主要是从自然界获得的高产菌种。那么如何从自然界中得到高产菌株呢？这就是接下来我要探讨的问题。摘要摘要：本论文通过培养基制备及灭菌、菌种分离纯化、菌种鉴定、培养条件优化以及诱变育种等五个实验，从土壤中筛选获得产淀粉酶细菌和选育高产菌株。从而掌握相关实验技术和方法，学会如何应用这些技术去解决科学实验和生产实践中的具体问题。关键词关键词：筛选、选育、诱变育种、高产菌株AbstractAbstract:This paper through culture medium preparation and sterilization,isol

3、ation purification,identification,optimization of culture conditions and mutation breeding of five experiments,screened from soil to obtain amylase produced bacteria and breeding high yield strains.In order tograsp the related experimental techniques and methods,learn how to apply these techniques t

4、osolve scientific experiments and production practice of the specific problems.Key wordsKey words:screening,breeding,mutation breeding,high yield strain实验原理实验原理：在自然界的土壤中存在产淀粉酶的细菌，通过土样悬液稀释涂布和平板划线分离于含有淀粉的培养基上，诱导产生淀粉酶。产淀粉酶的细菌可在菌落周围水解淀粉出现水解圈。滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。通过计算水解圈大小（H）和菌落大小（C）的比值获得产淀粉酶能力强的菌落。通过形态学

5、鉴定和分子鉴定确定产淀粉酶菌株的种类。并将之转接于不同条件的液体摇瓶发酵培养基中培养一段时间后，计算淀粉酶酶活，得到最佳培养条件。然后在紫外线下照射，对诱变后的菌种进行筛选和复筛得到产淀粉酶的高产菌株。1 1 材料和方法材料和方法1.11.1 样品采集样品采集分离样品来源：2010 年 11 月 15 日于 33 幢宿舍楼下花坛采集土壤若干，装于信封中。鉴别培养基为淀粉培养基、优化培养基为摇瓶发酵培养基。1.21.2 方法方法1.2.11.2.1 产胞外淀粉酶细菌的分离和筛选产胞外淀粉酶细菌的分离和筛选2/8将新鲜土样依次稀释至 10-3、10-4 稀释度，分别涂布于淀粉培养基中，再将 10-

6、1 的土壤稀释液在一块淀粉培养基上进行划线分离，将这3 块培养基倒置于恒温箱培养。24 小时后，选取典型细菌菌落，并用记号笔进行编号。将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的 1 块淀粉培养基平板上分别点种。在 3 块淀粉培养基滴加路哥氏碘液显色，观察水解圈并测量菌落大小(C)和水解圈大小(H)。找到水解圈最大的1-2 个菌落和编号，在对应编号的点种平板上做好标记。将点种平板继续置于30培养。1.2.21.2.2 产淀粉酶菌种的鉴定产淀粉酶菌种的鉴定（一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定首先进行培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等；再用显

7、微观察细菌细胞：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？最后对细菌进行革兰氏染色：是革兰氏阳性菌还是阴性菌。(二)细菌的 16S rDNA 分子鉴定从平板上取单菌落加入 20l 无菌水，100加热 10 min。轻微离心后，取5l 作为模板。反应体系：在一个 PCR 管中用微量移液枪依次加入列物质：Taq buffer（10）2.5lMgCl2（25mM）1 ldNTP（2.5 mM）2.5 lPrimer Forward（50 mM）1 lPrimer Reverse（50 mM）1 lddH2O16.5 lrTaq（2U/l）0.5 lPCR 反应条件：95预变性 5 m

8、in 后，95变性 1 min，59退火 1min，72延伸 1min，共 25 个循环，72延伸 10min。（三）琼脂糖凝胶电泳1.制胶：配制 0.7%琼脂糖溶液 20mL，用 1TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固；2.制样：PCR 反应结束后，取出 PCR 管，吸取 5 l 与 1l 6样品 Buffer 混合后全部点入浸于 TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中；3.电泳：100V 电泳 20min；3/84.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的 DNA 条带（约 1.5Kb

9、），则认为是 PCR 阳性，这时将与此电泳样品对应的 PCR 反应管放置冰箱短期保存。（四）PCR 扩增片段测序获得的 PCR 阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。（五）序列比对分析使用 NCBI 对待测菌的 16SrDNA 序列与数据库中各种菌的 16SrDNA 序列进行比对。登陆.ncbi.nlm.nih.gov美 国 国 立 生 物 技 术 信 息 中 心，使 用BLASTn在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从 Genebank 中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的 16

10、SrRNA 基因序列,初步确定待测菌的分类位置。用 Clustal 软件将已知分类菌株的 16SrRNA 序列与待测菌的 16SrRNA 序列进行多序列比较。1.2.31.2.3 培养条件的优化培养条件的优化（一）发酵液接提前 24h 将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按0.5接种量分别转接如下六种液体摇瓶发酵培养基。1.pH 4.02.pH 7.23.碳源淀粉 4.碳源葡萄糖5.氮源硝酸钠 6.氮源硫酸铵(二)菌种保藏挑取平板菌落，在斜面试管培养基上划线，30培养，然后置冰箱低温保藏。(三)菌体生长量的测定将培养 24h 后液体摇瓶培养物分别取出2mL 于试管中，加入8mL

11、蒸馏水，进行5 倍稀释。将各稀释液分别倒入比色杯中，在721 型分光光度计 600nm 波长下测定吸光值(OD600值)。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600 值大小，评价对菌体生长量的影响。（四）不同条件对淀粉酶活性的影响测定加入试剂1的淀粉溶液测定管0.1mL空白管0.1mL4/8缓冲液0.1mL摇匀后 40恒温水浴保温 5min0.1mL发酵液蒸馏水0.2mL-摇匀后 40保温 15min-0.2mL乙酸溶液0.5mL8000rpm 离心 5min取上清,加入 1mL 稀碘液试管中加蒸馏水稀释至 10mL0.5mL计算淀粉酶酶活：显色后，立即于660nm 波长测定其吸光度（A

12、）。计算各样品吸光度大小酶活力。即以 1mL 粗酶液在 40，pH6.0 条件下 15min 所分解 0.1mg 的淀粉质量为 1 个酶活力单位。A空白管A测定管A空白管（）1150.2100.1150.1比较各发酵菌液酶活力，判断哪种培养条件下酶活力最高。1.2.41.2.4 产淀粉酶菌种紫外诱变育种产淀粉酶菌种紫外诱变育种(一)菌种的活化与接种培养 24 h 后，挑取一环活化菌株，接种至含 10ml 淀粉培养基的 50ml 三角瓶中，于 25，150 r/min 的摇床中振荡培养。(二)诱变1.菌悬液的制备：取出培养约24h 的摇瓶，分别取1ml 菌悬液（吸取前三角瓶要摇匀）于2个离心管中

13、，5000 r/min 离心 5min，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，加入1.5ml 无菌生理盐水制成菌悬液。2.平板制作：融化淀粉培养基，倒4 块平板，在平板上做好标识。3.诱变处理：(1)开启紫外灯预热 10-20 min。(2)紫外处理：取制备好的菌悬液3 mL 移入 6 cm 的无菌培养皿中，将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开皿盖，距离紫外灯管30cm，照射 3min，盖上皿盖。5/8(3)稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10 倍稀释法依次稀释成10-1-10-5（dorf 管中稀释）。(4)涂布平板：取 10-3、10-4（紫外照射 3min）两个

14、稀释度的菌悬液各0.1ml 涂布均匀。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。平板于 37倒置培养 48 h(用黑布包好平板)。（三）计算成活率和致死率1.存活率：将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。2致死率：将培养 48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。（四）观察诱变效应在平板菌类计数后，分别向菌落数在5-6 个左右的平板内加入碘液，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(H/C 值)，与对照平板进行比较（紫外照射和对照组随机选出6个算平均值）。选取 H

15、/C 比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养，用于复筛。2 2 结果与分析结果与分析2.12.1细菌的分离与鉴定细菌的分离与鉴定：在 10-3 的培养基上典型的菌落有12 个分别编号 112；在 10-4的培养基中有 7 个分别编号为 1319；在划线培养基中有5 个分别编号为 2024。滴加碘液显色后发现 5、13、17、18、21 的水解圈明显较大。计算其H/C 值得表如下：菌落号水解圈直径(H)mm菌落直径(C)mmH/C 值53.2132.6171.8182.9212.41.22.670.73.710.53.60.93.220.73.436/8得 13 号菌株为最佳菌株。2.22.2

16、产淀粉酶菌种的鉴定：产淀粉酶菌种的鉴定：形态特征的观察与鉴定：菌落为乳白色，较小，中央有微小隆起，表面较光滑。革兰氏染色为紫色，说明为阳性菌。显微镜下为长杆状，个体较大。琼脂凝胶电泳结果：泳动较慢，说明该菌的DNA 分子的分子量较大。PCR 扩增片段测序：通过序列比对分析初步确定为超大芽孢杆菌。2.32.3 培养条件的优化：培养条件的优化：OD600 值计算：测得的 OD600 的值如下：试管号OD600值10.72720.89530.79540.08750.71960.483可得试管、3、5 中的菌体生长量较大。淀粉酶酶活：测得的淀粉酶酶活值如下：离心管号吸光度(A)淀粉酶活性11.0316

17、.57121.1162.99131.1342.23340.32136.47950.74118.78760.6180空白管）1.18723.968可得离心管 4、5、6 的淀粉酶的活性较大。（在测量酶活时由于把写有编号的试管塞取了下来，导致编号顺序错误，以上的编号为离心管的编号。根据另外几组的实验结果可得试管2、3、5 的酶活比同组变量的大。）综合以上两组数据知：该菌株的最佳培养条件是40，PH=7.2，氮源为硝酸钠，碳源为淀粉。2.42.4 产淀粉酶菌种紫外诱变育种：产淀粉酶菌种紫外诱变育种：经紫外照射后的 10-3 的细菌存活率为 72%和致死率为 28%，10-4 的细菌存活率为33.33%和致死率为 66.67%。紫外线照射处理结果:稀释度菌落数10-3210-4187/8复筛得到产淀粉酶的高产菌株。参考文献：1 陈双林等著.袁生主编微生物学M高等教育20092 胡宝龙等著周德庆主编微生物学实验教程M高等教育20063（美）特拉诺（Talaro,K.P.）著Kathleen Park Talaro主编微生物学基础M高等教育20054 李根喜等著杨荣武主编生物化学原理M高等教育出版8/8