细胞培养技术修改版.pdf

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1、实验一实验准备工作一、器材与药品（每实验室准备量）（一）普通器材（一）普通器材名名称称普通天平大酒精瓶量筒500ml 盐水瓶玻璃棒火柴，标签纸，记号笔等数数量量1 台3 只1000ml、250ml 各一只1 只2 支备备注注（二）无菌器材（二）无菌器材名名称称100ml 或 250ml 盐水瓶大翻10ml 吸管5ml 吸管1ml 吸管青霉素瓶青霉素瓶塞数数量量70 只70 个3 支5 支1 支120 只120 个备备注注（三）药品（三）药品名名称称重铬酸钾浓 H2SO4双蒸水青霉素链霉素NaHCO3，KCl，NaCl，Na2HPO412H2O，KH2PO4，结晶紫，甲醛，无水酒精等数数量量24

2、00g4000ml5000ml10000 单位/ml10 000g/ml备备注注由技术室提前准备1二、实验内容（一）配清洁液（一）配清洁液成成分分重铬酸钾浓硫酸自来水量量2400g4000ml20000ml备备注注重铬酸钾溶于水中有时不能完全溶解，预先用2000ml 热水助其溶解，再加入足量自来水，最后缓慢加浓硫酸。切记：浓硫酸要缓慢加入，且边加边搅拌！切记：浓硫酸要缓慢加入，且边加边搅拌！（二）其他培养用液的配制及分工（二）其他培养用液的配制及分工（学生分为三大组）1 1、RPMI-1640RPMI-1640 培养液培养液成分成分RPMI-1640量量2 袋备备注注搅拌溶解后过滤除菌，每瓶按

3、100ml分装，塞好大翻，并注明名称配制日期和组别。每实验室 20 瓶。每小组 1 瓶。NaHCO34.0 g2000ml 大酒精瓶 1 只；无菌 100ml 盐水瓶 20 只。2 2、无菌分装、无菌分装 5.65.6NaHCONaHCO3 3成分成分量量备备注注按照 3ml/瓶分装，每室 16 瓶，每小组 1 瓶。无菌操作。无菌 5.6NaHCO350ml无菌青霉素瓶 20 只；无菌 5ml 吸管 1 支。3 3、无菌分装、无菌分装 1 1胰酶胰酶（技术室提供）按照 1ml/瓶分装，每室 15 瓶。每小组 1 瓶。成分成分量量备备注注按照 1ml/瓶分装，每室16 瓶，每小组 1 瓶。无菌

4、1胰酶20ml无菌操作。无菌青霉素瓶 15 只；无菌 1ml 吸管 1 支。24 4、HanksHanks液液（母液由技术室提供）成分成分A 液B 液双蒸水量量1001001800备备注注按照 1：1：18 比例进行配比混匀，总量为2000ml，过滤除菌，然后按照每瓶500ml分装，并注明名称配制日期，每室4 瓶。无菌 10ml 吸管 2 支，1000ml 量筒 1 只，1000ml 大酒精瓶 1 只，无菌 100ml 盐水瓶 20 只。5 5、双抗、双抗成分成分青霉素（80 万 U）链霉素（1g)无菌 Hank s液量量2 瓶1 瓶100ml备备注注配制双抗终浓度为：16000 单位/ml；

5、链霉素10000g/ml。按 5ml/瓶分装，瓶口贴好胶布作好标记，胶布上注明配制日期和组别。每室 20 瓶。每小组 1 瓶。4保存备用。无菌 5ml 吸管 1 支，无菌青霉素瓶 20 只。6 6、血清的灭活和分装、血清的灭活和分装成分成分量量备备注注总量为 150ml，56的水浴锅中进行热灭活，灭无菌小牛血清150ml活时间 30min，后按照每瓶 5ml 分装，并在瓶口处贴好胶布作好标记，胶布上写好日期和组别。每实验室 30 瓶。每小组 2 瓶。20保存备用。无菌 5ml 吸管 1 支，无菌青霉素瓶 30 只。37 7、1 1PBSPBS 配制配制成分成分NaClKClNa2HPO412H

6、2OKH2PO4去离子水量量8.0 g0.2g2.9g0.2g至 1000ml备备注注总量为 1000ml，每瓶按 70ml 分装，用硫酸纸包好瓶口，待高压灭菌后第二天派人再换大翻保存。每实验室 15 瓶。每小组 1瓶。标好 1000ml 刻度的酒精瓶或 1000ml 容量瓶 1 只，无菌 100ml 盐水瓶 15 个。8 8、染色液、染色液成分成分结晶紫甲醛NaCl无水乙醇去离子水量量0.5g10ml0.8g50ml加至 100ml备备注注溶解、混匀，滤纸过滤250ml 量筒 1 只，500ml 盐水瓶 1 只。9 9、分装、分装 VTPVTP（由技术室提供）成分成分量量备备注注无菌操作按

7、4ml/瓶分装，并注明日期和组无菌 VTP70ml别。每实验室 15 瓶。无菌 5ml 吸管 1 支，无菌青霉素瓶 15 只。未特别说明上述试剂均放置 28冰箱保存备用。每次实验除菌过滤的顺序：三个班的 RPMI-1640 先滤，然后再滤 Hank s 液。每组完成后统一收好，下次再分配到各小组。备注：常规实验室用品注意更换，包括酒精缸和酒精灯，棉球，一次性台布等。4实验二实验二鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养一、实验目的掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；掌握活细胞的显微镜下观察；熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、实验原理离体动物组织通过温和的手段

8、（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。三、实验材料（按 2 人/组的量发放）911 日龄鸡胚 1 只，碘酒和酒精棉球若干，无菌器械一套，无菌无毒平皿 2只；5 或 10ml 吸管 4 支，1 或 5ml 吸管 1 支

9、，长青霉素瓶 2 只（带塞）；Hank s 液 1 瓶，RPMI-16401 瓶，双抗 1 瓶（5ml）；胰蛋白酶 1 瓶（1ml），血清 1 瓶（5ml），5.6NaHCO31 瓶四、操作步骤1、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；2、取出两只无菌平皿，并标记和，待用。3、在RPMI-1640 和 Hanks 液中分别无菌操作以 1的量加入双抗，吸出1015mlHanks 液至无菌平皿中备用；4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳；5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有 Hanks 液的平皿中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有 Hanks 液的平皿中，

10、再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约 0.51mm3的小块（约 250 次），此时体积约 0.5ml；用 Hank s 液洗涤两次。57、加入 1 ml 1胰蛋白酶，用适量 Hank s 液调整使其工作浓度为 0.25，5.6NaHCO3调节 pH 至约 7.38.0（肉眼观为肉红色，1 ml 吸管约 3 滴）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37水浴中，开始计时，约1530min，其间缓慢摇匀以充分消化。消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好。9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用 Hanks

11、 液小心洗涤 23次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入 RPMI-1640 液约 5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清；重复操作 34 次，收集细胞上清。10、（1）经四层无菌纱布或 200 目不锈钢钢网过滤后收集滤液，细胞计数，并调节细胞密度大约 1106/ml；（2）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为 10）。11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到两个细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等。12、细胞统一置于本室指定的 37，5CO2孵箱

12、中培养。13、24h 后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。6实验三实验三 滤泡性口炎病毒（滤泡性口炎病毒（VSVVSV）的增殖（纯培养）的增殖（纯培养）一、实验目的掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、实验原理原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞

13、变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。三、实验材料（按 2 人/组的量发放）200TCID50的 VSV 病毒 0.1ml，5ml 和 1ml 吸管各一支，维持液（含3小牛血清的 RPMI-1640 液）。四、操作步骤1、上述原代成纤维细胞培养24h 后，一旦细胞完全贴壁生长良好后，则轻弃培养上清，换上细胞维持液（含3小牛血清的RPMI-1640），接种200TCID50的VSV0.1ml，在细胞瓶上标记换液时间，接种病毒量。正常对照也按照上述方法换上维持液。2、再继续培养，每间隔1224h 观察，直至全部细胞出现明显的病变，显微镜观察细胞脱落，圆缩，则可停止培养。3、收集全班的病毒培养物于100m

14、l 无菌盐水瓶中，写好标记，置于20冰箱充分冷冻后再置于 4冰箱或室温下解冻，该过程称为冻融。反复冻融三次后，细胞膜破坏，释放出胞内病毒。低速离心，弃细胞碎片沉渣，收集上清即为病毒悬液。留样测定病毒的 TCID50。五、实验结果1、鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察。2、VSV 攻击鸡胚原代成纤维细胞后，细胞病变效应（CPE）的观察。3、病毒收获的方法。7实验四实验四 Hep-2 Hep-2 细胞的传代培养细胞的传代培养一、实验目的掌握细胞传代培养的方法及其应用。二、实验原理体外培养的细胞由于细胞游出数量增加，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空

15、间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞继续生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。细胞培养传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、实验材料传代细胞：人喉癌细胞（Hep-2）（每两人一瓶）；所需溶液：PBS、VTP、RPMI-1640 液、血清；其他：5 ml 吸管、10ml 吸管、细胞瓶。四、操作步骤1、将已长成单层的细胞生长面朝上轻轻倒掉培养液，用PBS 轻轻洗涤两次，注意吸管尖头不要伸到细胞

16、瓶中。2、用上述吸管吸取 1mlVTP 加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约 35min。显微镜下观察细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，即可停止消化。尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。3、加入少量 RPMI-1640 液于细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞使细胞充分均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。4、计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量 0.04台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。计算细胞浓度。5、用 RPMI-16

17、40 制备成 1106/ml 浓度的细胞悬液，并按 10的量加入小牛血清。6、将上述细胞悬液分装 5ml 到新细胞瓶中，塞好塞子，标记后送培养箱培养，824h 后观察。五、实验结果显微镜下观察 Hep-2 细胞生长良好，已长满单层，细胞呈不规则多边形，透光性良好。实验五实验五 VSV TCIDVSV TCID5050滴定滴定一、实验目的掌握病毒 TCID50滴定的基本原理和计算方法以及应用。二、实验原理多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathic effect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得

18、以识别和判断。CPE 的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的50组织细胞感染指数（50tissue culture infectious dose，TCID50）。测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做 10 倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般 48h即可；VSV 增殖也较快，因此，48h72h 也可以观察、染色、计算。三、实验材料细胞：Hep-2 细胞株（实

19、验四传代所得），自备/组。病毒：水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），自备/组。试剂：维持液，PBS，VTP 等自备/组。材料：细胞板（1 块/组），tip 头（2 盒/排），微量移液器，5ml 或 10ml 吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10 个/排），酒精缸，镊子（2 个/排）四、操作步骤1、制备细胞：方法同实验四。一瓶细胞消化后加入营养液制成所需细胞悬液，浓度约为 1106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入 40 孔板微孔中，每孔 100l，937，5%CO2孵育箱培养 24h，形成单层后，做病毒滴定用。2、50%组织细胞感染量（TCID50）

20、测定（1）稀释病毒液：取无菌青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加 VSV 病毒液 0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液 0.3ml 加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液 0.3ml 加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续 10 倍稀释，使病毒稀释为 10-1，10-2，10-310-9。（2）病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的 VSV 病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加 2 孔，每孔 100l。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置 37，5%CO2孵育箱中孵育。（3）结果观

21、察：于孵育后 18、24、36、48、72h 在倒置显微镜下观察 CPE，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落现象。“-”表示细胞正常；“+”25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”50%细胞产生病变；“3+”75%细胞产生病变；“4+”100%细胞产生病变。（实验时，观察 24h48h 即可染色计算）3、计算 TCID50参见下表表VSV 在 Hep-2 细胞上的 TCID50结果记录病毒稀释度病变孔数/接种孔数10-310-410-510-610-710-88/82/80/80/80/80/8累积数（孔）有病变1020000无病变0614223038病变细胞孔比例10/102/80/140/

22、220/300/38百分比（%）100250000按表中，10-3稀释的病变高于 50%；10-4稀释的病变低于 50%；50%病变分布于 10-3与 10-4之间，计算公式如下：距离比例=-lg 稀释倍数=-lg10高于 50%的病变率-低于 50%的病变率100-25=-0.67lg TCID50=高于 50%病变的低稀释度对数+距离比=-3+(-0.67)=-3.67即 1 个 TCID50=10-3.67，查 0.67 的反对数为 4.68，即病毒做 4.68103倍稀释时取 0.1ml 接种细胞，即可使 50%细胞产生病变。10高于 50%病变率-（50%）100-50附录：如何计算

23、 200 个 TCID50？4.38103200=23.4，将病毒作 23.4 倍稀释时即得 200 个 TCID50。五、计算请计算提供的病毒的 TCID50。六、写实验报告并计算给定的病毒的 TCID50。实验六实验六 干扰素活性（效价）的测定干扰素活性（效价）的测定（注：此实验所需的细胞为实验四时传代培养所得）一、实验目的一、实验目的掌握微量细胞病变抑制法测定干扰素效价的基本步骤以及结果分析。熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。了解影响结果的常见因素。二、基本原理二、基本原理病毒或其他干扰素诱生剂作用于巨噬细胞、T 细胞或成纤维细胞后，由细胞基因自身编码产生的具有抗病毒、抗肿瘤和调

24、节免疫功能的一类小分子糖肽，统称为干扰素。干扰素发挥重要的酶的特性而抑制病毒 DNA 和蛋白质的合成，从而抑制病毒在细胞内的增殖。因此具有间接的广谱抗病毒作用。为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定。干扰素效价一般定义为：凡 1ml 干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的效价，即单位/毫升。三、测定方法三、测定方法测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制法”（Method ofCytopathic effect inhibition assay，简称 CPE 法）。此法的

25、主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常规。亦可用“放射化学测定法”、“染料摄入测定法”。本次实验也主要采用前法。下面就此法的发展做一简要阐述。1、全量细胞病变抑制测定法11优点：操作简单、易于掌握、结果可靠缺点：大量测定时，耗费细胞量太大，清洗工作量大，判断结果不能完全排出主观因素。2、常规微量细胞病变抑制测定法此法是在“全量法”基础上加以改良的一种方法，它的最大优点是：需用细胞量少，适于大量干扰素标本检测。其主要缺点是：判断结果不能完全排除主观因素。具体操作形式有：先使细胞培养 2448h 形成单层后，再加入不同稀释度的干扰素孵育 24h，弃去，再加入 100TCI

26、D50的攻击病毒，继续孵育直至病毒对照出现完全病变为止。主要特点是干扰素稀释标本和细胞同时加，优点是细胞对攻击病毒较敏感，且省时。两种方法滴定的干扰素效价无明显差别。3、微量快速检测法（一步快速法）本法的特点是干扰素（不同稀释倍数）、细胞（一定浓度）和病毒（一定量）三者同时加入。因为干扰素诱导细胞形成“抗病毒状态”要先于病毒的复制与成熟，即 VSV 的复制周期为 7h，而干扰素作用于靶细胞后约 1h 即形成抗病毒状态。但一步快速法的敏感性随病毒攻击剂量的提高而迅速下降。因此常规微量法比微量快速法稳定。四、材料准备四、材料准备待测标本：为了除去非干扰素抑制物，待测标本应作（1）离心处理；（2）p

27、H处理（此步学生不需做）。可分装为 2040l/份/2 人。测定细胞：应根据“种属特异性”选择测定细胞。本实验室选用生长良好的一日龄或两日龄人羊膜单层细胞传代培养物(WISH)或人喉癌上皮细胞（Hep-2），本次实验选取后者。攻击病毒：选用具有“同步致病作用”的 VSV(Vesicular Stomatitis Virus)作为“攻击病毒”。使用前，应先在原代鸡胚成纤维细胞培养物（约 400 万细胞/毫升）中传代增殖及滴定病毒的空斑形成单位（PFU）或在人羊膜单层细胞上滴定其TCID50。病毒的攻击量一般可选 100300 个 TCID50（一般不得小于 10 个 TCID50，不得大于 50

28、0 个 TCID50）。胰蛋白酶混合消化液：VTP，其胰蛋白酶和 Versene 的最终浓度分别为 0.05 和0.02。用 VTP 比单用胰蛋白酶作消化液对细胞的损伤要小些。营养培养基：配方是（1）RPMI-1640 液；（2）10%灭活小牛血清；（3）双抗。最后用 NaHCO3调 pH 至 7.27.4。微量细胞培养板：无菌 40 孔进口板 1 块/组。12CO2培养装置：采用 CO2孵箱（CO2为 5%，空气为 95%）。其他器材：5ml 吸管 2 只/组，1ml 吸管 1 只/组，tip 头 1 盒/桌。五、操作步骤五、操作步骤1、稀释待检干扰素（在微量滴定板上直接进行）（1）配制 1

29、0小牛血清的营养液 5ml，除第一列外，在第一、二排的第210孔各加 100l 营养液；（2）将待检干扰素进行 400 倍稀释后，分别取 100L 于第一孔和第二孔，将第二孔充分吹吸 3 次混匀，吸出100l 于第三孔，重复上述操作，直到第8 孔，吹吸后弃去 100l。因此依据倍倍稀释原则对干扰素进行系列稀释，各孔的稀释倍数如下表所列。第九孔为细胞对照孔，不加干扰素保护也不加病毒攻击；第十孔为病毒对照，不加干扰素保护加病毒攻击。第二排按照同样方法进行，即每个稀释度重复两孔。每孔含量为 100l。9 9（细胞（细胞对照孔）对照孔）1001010（病毒（病毒对照）对照）100管号管号营养液营养液（

30、L）1 12 23 34 45 56 67 78 8100100100100100100100干扰素干扰素（L）100100上一孔的 100上一孔的 100上一孔的 100上一孔的 100上一孔的 100上一孔的100，弃去 100干扰素稀干扰素稀释倍数释倍数细胞细胞1：4001：8001：16001：32001：64001：128001：256001：51200每孔均为 100l2、微量单层细胞培养（1）按常规方法将预先培养好的细胞单层用 VTP 消化下来；（2）用营养培养基将细胞制成 40 万个细胞/毫升的悬液；（3）用加样器向微量细胞培养板每孔中加入 100L 细胞悬液（加时不断摇匀瓶中

31、的细胞）；（4）置 CO2孵箱中培养 1d。3、病毒攻击观察到细胞单层良好时，将各孔内含干扰的培养液倒掉，于每孔中加入100TCID50的攻击病毒 VSV100l，该病毒用 3维持液稀释，细胞对照组加入等量的维持液。13本组加入 24h 引起 75100%细胞病变的 VSV100l。置 37孵育 2440h。4、观察结果（1）可直接倒置显微镜观察。在规定的时间内首先观察“细胞对照组”和“病毒对照组”，若病毒对照组各孔中的细胞出现 75100的明显病变和死亡，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。否则弃去重做。每孔中出现的细胞病变（CPE）程度，用表示。一般

32、病毒对照孔，出现 3或 4，干扰素保护孔 CPE 不再进展，则可终止反应，并染色。（2）结晶紫染色：将上述反应板取出，弃去孔内液体于消毒液中，每孔加入1 滴染色液，35min 后，弃去，洗净孔内残余液体，控干即可记录结果。细胞着色的深浅可以直观反应 CPE 出现的程度，一般时板孔内几乎无可见的细胞贴壁层，无 CPE 时则板孔内细胞贴壁层完整。六、结果判断与计算分析六、结果判断与计算分析1、效价单位：效价以单位/毫升表示一般判定法：凡 1ml 干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（50）免受“攻击病毒”损害者，该稀释度的倒数即为干扰素的单位/毫升。如某干扰素稀释到1:8000 时仍能保护半数细

33、胞（50）免受“攻击病毒”的损害，即出现的稀释度，则该干扰素的效价即为 8000 单位/毫升。特殊计算法（通常按照 Reed-Muench 法计算）第一步第一步计算保护百分比，见下表A A 项项干扰素稀释度B B 项项病变细胞管 1管 2C C 项项正常细胞D D 项项平均数E E 项项累积病变正常F F 项项比例G G 项项百分比管 1管 2病变正常正常/(正常（）病变)16/1612/128/95/83/81/9001001008963381100（）（）1：400（22102）1：800（230）0122001223444432210044322100001223444432210000

34、135812161612853100 10421：1600（2 102）1：3200（25 102）1：6400（26 102）1：12800（21：25600（21：51200（27 102）38 102）429 10）4A、B、C 项为原始数据，4表示全部细胞病变；3表示 75细胞病变；142表示 50细胞病变；1表示 25细胞病变。第二步求出干扰素单位从上表中可大略看出，此批干扰素能保护半数（50）细胞不被“攻击病毒”损害的最高稀释度在 1:32001:6400 之间。因此，可通过下式求出其距离比。高于 50的百分比506350距离比0.52高于 50的百分比低于 50的百分比6338即

35、此批干扰素稀释到 25.52 102（1:4588）时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”损害，其结果可记为 5.52Log2+2 单位/毫升（5.52Log22 u.ml1）。2、工作单位修正各实验室所测得的干扰素单位，习惯上一般都称为该实验室“工作单位”。为了表明某种干扰素效价的高低，就必须用同型国际干扰素参考制剂加以修正。例如，当我们要修正本实验室所制备的兽用白细胞干扰素的效价时，就应当：（2）并在相同条件下测出兽用白细胞干扰素参考制剂的工作单位（R2）（3）测出本实验室所制兽用白细胞干扰素的工作单位(X2)（4）按下式求出本室所制兽用白细胞干扰素的修正单位（X1）：R1:X1=R2：X2例

36、如设：R1=5000 单位，R2=10000 单位，X2=8000 单位；则按上式可求知：X1=4000 单位。（1）查明兽用白细胞干扰素参考制剂的标准单位(R1)15实验七实验七滤泡性口炎病毒（滤泡性口炎病毒（VSVVSV）中和试验）中和试验（稀释血清固定病毒法）（稀释血清固定病毒法）一、实验目的一、实验目的测定血清中的 VSV 中和抗体效价二、实验原理二、实验原理特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必须有一定效价的中和抗体。根据稀释成分不同可分为两种方法。一为固定病毒用量（100TCID50）与等量

37、一系列倍比稀释的血清进行中和试验，以血清中和抗体滴度表示。二为固定血清用量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。结果以中和指数表示。三、实验材料三、实验材料VSV 动物免疫血清（S1、S2，1:10 稀释后 56 30min 灭活）、100TCID50VSV 病毒悬液、稀释液（无血清 RPMI-1640）、营养液（含 10小牛血清的 RPMI-1640）、40 孔平底细胞板、Hep-2 细胞一瓶、吸管、加样器等。四、实验步骤四、实验步骤1、40 孔板每孔加稀释液 50l，作好标记，按图示进行。每块板做2 个血清标本（S1、S2）。S 对照1:201:401:801:1601:3201:640

38、1:1280C 对照V 对照S1S22、取1:10 灭活血清，第1、2 孔分别加入 50l；从第2 孔吹吸 3 次，吸出50l 至第 3 孔，吹吸 3 次，吸出 50l 至第 4 孔依次直至第 8 孔，吸出 50l弃去。第 9 孔细胞（C）对照，第 10 孔病毒（V）对照均不加血清。3、加入预先制配好 100TCID50 VSV 病毒悬液，每 50l/孔，C 对照及 S 对照不加病毒。最后每孔总量 100l，C 对照及 S 对照补充稀释液至 100l/孔。4、置 37 温箱，孵育 1h。5、利用此 1 小时制备 Hep-2 细胞悬液并加入上述混合液中。Hep-2 一瓶，PBS 洗涤 2 次VTP 1ml 消化约 5min 后倾去37至细胞从玻璃瓶脱落加入 1640 营养液 6ml，细胞计数，调整细胞数成 1106/ml，每孔加 100l 细胞悬液。37 5CO2孵育，24h 观察结果。16五、实验结果五、实验结果用倒置显微镜观察。首先观察对照：V 对照（3+4+）；S 对照（/）；C 对照（）。以病变作为指标，能抑制病毒 CPE 的血清最高稀释度为中和抗体的效价（滴度）。17