环境微生物学教学课件13-2生长量测定方法.ppt

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1、细菌生长细菌生长（数量）（数量）测定方法测定方法（一）（一）直接计数法直接计数法（测微生物总数）（测微生物总数）借助显微镜观察测定借助显微镜观察测定n n优点：优点：优点：优点：快速快速快速快速n n提问提问提问提问:有哪些缺点有哪些缺点有哪些缺点有哪些缺点?n n缺缺缺缺点点点点：不不不不能能能能区区区区分分分分细细细细菌菌菌菌的的的的死活死活死活死活n分四种分四种 1.1.涂片染色法涂片染色法1 1视野菌液视野菌液(ml)(ml)(0.01(0.01mlml 1 1cmcm2 2)*)*视野面积视野面积视野面积视野面积(cm(cm2 2)2.2.计数器计数器(血球计数板）血球计数板）血球计

2、数板）血球计数板）测定法测定法0.050.052 2cmcm2 2 25250.1ml0.1ml菌液菌液提提问问：数数了了125个个小小格格中中有有90个个细细菌菌，样样品品中中的的细细菌菌浓浓度度是是多少？多少？(90个个125)*400/0.1ml=2880个个/ml适用范围：适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细细菌菌个个体体若若太太小小、过过多多，由由于于每每一一小小格格中中细细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数一般数125个小格个小格），），折算折算样品细菌浓度；

3、样品细菌浓度；3.3.比例计数法比例计数法n n比例比例比例比例样品菌液与等体积的血液混合，样品菌液与等体积的血液混合，样品菌液与等体积的血液混合，样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例观测二者比例提问：提问：提问：提问：如果如果如果如果平均每个视野中平均每个视野中细菌数量细菌数量/红血球红血球的数量的数量比例为比例为5.55.5：1 1，则细菌数量，则细菌数量=？5.54005.5400万个万个/m l/m l=2.210=2.2107 7个个/mLmL样品样品n红红血血球球数数已已知知(男男性性400500400500万万万万个个个个mlml，女女性性350450350450万万万万个个

4、个个mlml)，平均平均400400万个万个/ml/ml细细细细菌菌菌菌红红红红血血血血球球球球 4比浊计数法比浊计数法n浊浊细菌悬浮液的浊度细菌悬浮液的浊度细菌悬浮液的浊度细菌悬浮液的浊度提问：提问：提问：提问：如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？n n细细细细菌菌菌菌不不不不完完完完全全全全透透透透光光光光，一一一一定定定定范范范范围围围围内内内内菌菌菌菌溶溶溶溶液液液液的的的的混混混混浊浊浊浊度度度度与与与与菌数量成菌数量成菌数量成菌数量成正比正比 （1）制标准曲线（）制标准曲线（ODNo）n n（2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量）测菌液浊度

5、，查图表得出细菌数量浊度仪浊度仪或或721721分光光分光光度仪度仪 （二）间接计数法（二）间接计数法(测定活菌数测定活菌数)n n提问：提问：提问：提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？n n繁殖繁殖n n提问：提问：提问：提问：细菌繁殖的可见现象是什么？细菌繁殖的可见现象是什么？细菌繁殖的可见现象是什么？细菌繁殖的可见现象是什么？n n产生菌落产生菌落产生菌落产生菌落（固体培养基培养）固体培养基培养）固体培养基培养）固体培养基培养）、菌液混浊、菌液

6、混浊、菌液混浊、菌液混浊（液体培养基培养）液体培养基培养）液体培养基培养）液体培养基培养）n n计数原理计数原理：一个一个细菌细菌细菌细菌可繁殖成可繁殖成可繁殖成可繁殖成一个一个菌落菌落菌落菌落或或或或一群细菌一群细菌一群细菌一群细菌.n n缺点：缺点：缺点：缺点：慢慢慢慢 n n分分分分固体培养法和液体培养法固体培养法和液体培养法无菌水无菌水n n1.1.1.1.稀释平板计数法稀释平板计数法稀释平板计数法稀释平板计数法固体培养法固体培养法固体培养法固体培养法第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释得到不同得到不同稀释度稀释度 （10-x）菌液菌液菌样被

7、菌样被菌样被菌样被无菌水无菌水无菌水无菌水不同稀不同稀不同稀不同稀释倍率释倍率释倍率释倍率后后后后平板平板平板平板培养图培养图培养图培养图 10-2 10-3 10-4 10-5 各各各各取取取取1ml1ml，均均均均匀匀匀匀涂涂涂涂布布布布于于于于冷冷冷冷固固固固体体体体培培培培养养养养基基基基平平平平板板板板上上上上或或或或与与与与温温温温热热热热液液液液态态态态固固固固体体体体培培培培养养养养基基基基混合混合混合混合冷却。冷却。冷却。冷却。第三步：培养第三步：培养第三步：培养第三步：培养稀稀稀稀 释释释释 度度度度过过过过 低低低低，菌菌菌菌 落落落落 密密密密集集集集 无无无无 法法法

8、法计数计数计数计数可可可可以以以以计计计计数数数数，但但但但数数数数量量量量过过过过多多多多，费费费费时时时时费力费力费力费力数量合数量合数量合数量合适，统适，统适，统适，统计计算，计计算，计计算，计计算，作为结作为结作为结作为结果果果果数数数数量量量量太太太太少少少少，误误误误 差差差差 因因因因 素素素素太太太太 大大大大，不不不不做计数做计数做计数做计数第二步：接种平板第二步：接种平板第二步：接种平板第二步：接种平板每一个细菌会生成一个每一个细菌会生成一个每一个细菌会生成一个每一个细菌会生成一个菌落菌落菌落菌落n n一一一一般般般般计计计计数数数数平平平平板板板板的的的的细细细细菌菌菌菌

9、生生生生长长长长菌菌菌菌落落落落数数数数以以以以3030030300个个个个为为为为宜。宜。宜。宜。n n第四步第四步第四步第四步：计数计数计数计数n细菌数量细菌数量=？n细菌数量细菌数量=数出的菌落数数出的菌落数/稀释度稀释度n例如：例如：10-5稀释度时菌落数为稀释度时菌落数为125个个n细菌数量细菌数量=125/10-5=1.25107个个/mLn 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法平板计数法是采用最广的一种活菌计数法n如国标法水中如国标法水中细菌菌落总数细菌菌落总数（CFUColony Forming Unit）的测定的测定 。n注注意意：作作空空白白及及取取平平行行样样（2 23

10、3组组）均均值值减减小小误差误差平均 2.稀释液体计数法稀释液体计数法n n特点：特点：特点：特点：液体培养、统计学查表计数液体培养、统计学查表计数液体培养、统计学查表计数液体培养、统计学查表计数n n又称又称又称又称MPNMPN法法法法 （或最可能数法）（或最可能数法）（或最可能数法）（或最可能数法）n nM Most ost P Probable robable N Numberumbern n例如例如例如例如测定测定测定测定SRBSRB（硫酸盐还原菌，硫酸盐还原菌，硫酸盐还原菌，硫酸盐还原菌，厌氧厌氧厌氧厌氧）的数量）的数量）的数量）的数量n n提问：提问：提问：提问：能用稀释平板法计数

11、吗？为什么？能用稀释平板法计数吗？为什么？能用稀释平板法计数吗？为什么？能用稀释平板法计数吗？为什么？n n一一一一般般般般不不不不能能能能，厌厌厌厌氧氧氧氧菌菌菌菌暴暴暴暴露露露露在在在在空空空空气气气气中中中中不不不不能能能能生生生生长长长长（除除除除非非非非厌厌厌厌氧氧氧氧培培培培养箱）养箱）养箱）养箱）n对这类菌可以利用它们生长时产生的对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征硫化亚铁黑色特征进进行行深层隔氧液体培养深层隔氧液体培养，按，按MPNMPN法进行计数。法进行计数。3 3 2 010 -4 10-5 10-63 10-10-2 10-3 10-4 10-5（1 1）稀释

12、）稀释）稀释）稀释（2 2）稀释接种样品）稀释接种样品）稀释接种样品）稀释接种样品在液体表面加一层无菌在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，液体石蜡隔绝氧气，恒温恒温37培养培养14天天记录变黑的试管情况记录变黑的试管情况（3 3）培养）培养）培养）培养1mlml+9mlml培培培培养养养养基基基基n n提问：提问：提问：提问：为什么有些试为什么有些试为什么有些试为什么有些试管变黑有些没有？管变黑有些没有？管变黑有些没有？管变黑有些没有？n n稀释程度、取样概率稀释程度、取样概率稀释程度、取样概率稀释程度、取样概率(4)统计查表计算统计查表计算 n n根据根据根据根据不同稀释度变黑试管不同稀释

13、度变黑试管不同稀释度变黑试管不同稀释度变黑试管n n统计出统计出数量指标数量指标n n三三三三位数及其中位数及其中位数及其中位数及其中最低稀释度最低稀释度最低稀释度最低稀释度n n（取（取（取（取变黑的管数最多变黑的管数最多变黑的管数最多变黑的管数最多、稀释度又最低稀释度又最低稀释度又最低稀释度又最低的的的的生长管生长管生长管生长管数数数数，为，为，为，为第一位第一位第一位第一位数字，数字，数字，数字，后面两个稀释度的后面两个稀释度的后面两个稀释度的后面两个稀释度的生长管生长管生长管生长管数数数数为为为为后两位数）后两位数）后两位数）后两位数）n n提问：提问：提问：提问：上例情况而言统计数量

14、是几？上例情况而言统计数量是几？上例情况而言统计数量是几？上例情况而言统计数量是几？n n查表查表n n表表表表MPN表表表表320 10-4MPNMPN三管法测数统计表三管法测数统计表三管法测数统计表三管法测数统计表水中大肠菌群水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也也用这种方法进行数量统计。用这种方法进行数量统计。个菌个菌个菌个菌/毫升毫升毫升毫升n n细菌最可能数细菌最可能数通过其他精确的计数法，确定通过其他精确的计数法，确定的各种的各种数量指标数量指标时时细菌数量的最可能值细菌数量的最可能值上面例子中数量指标上面例子中数量指标上面例子中数量指标上面例子中数量指标

15、“320320”对应的细菌最可能数为对应的细菌最可能数为对应的细菌最可能数为对应的细菌最可能数为9.59.5个菌个菌个菌个菌/毫升毫升毫升毫升，最低稀释度为最低稀释度为最低稀释度为最低稀释度为1010-4-4，折算出样品中菌浓度为折算出样品中菌浓度为折算出样品中菌浓度为折算出样品中菌浓度为？个菌个菌个菌个菌/毫升。毫升。毫升。毫升。3.薄膜计数法薄膜计数法n n薄膜薄膜薄膜薄膜微孔滤膜微孔滤膜微孔滤膜微孔滤膜（0.45um0.45um）（2 2）滤膜培养）滤膜培养）滤膜培养）滤膜培养膜有菌面冲上膜有菌面冲上膜有菌面冲上膜有菌面冲上n n原理原理原理原理膜抽滤膜抽滤膜抽滤膜抽滤（细菌浓（细菌浓（

16、细菌浓（细菌浓缩）缩）缩）缩）+膜平板培养膜平板培养膜平板培养膜平板培养 +计计计计数数数数（1 1）抽滤）抽滤）抽滤）抽滤（滤器及膜事先灭菌）（滤器及膜事先灭菌）（滤器及膜事先灭菌）（滤器及膜事先灭菌）n n（3）统计计数）统计计数n n提提提提问问问问：假假假假如如如如 测测测测出出出出2 2 2 250505050个个个个菌菌菌菌落落落落，抽抽抽抽滤滤滤滤了了了了50ml50ml50ml50ml自自自自来来来来水水水水，自来水中菌浓度是多少呢？自来水中菌浓度是多少呢？自来水中菌浓度是多少呢？自来水中菌浓度是多少呢？n n25050ml=525050ml=5个个个个/mlml自来水自来水自

17、来水自来水n n样品中的细菌数量样品中的细菌数量样品中的细菌数量样品中的细菌数量=菌落数菌落数菌落数菌落数 抽滤样品的体积数抽滤样品的体积数抽滤样品的体积数抽滤样品的体积数n n要求要求要求要求样品洁净样品洁净样品洁净样品洁净n n如空气或饮用水如空气或饮用水如空气或饮用水如空气或饮用水。n？n n堵孔、菌太多难以分散堵孔、菌太多难以分散堵孔、菌太多难以分散堵孔、菌太多难以分散n n提问：提问：提问：提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？如何用活菌计数法测定较脏的水样？如何用活菌计数法测定较脏的水样？如何用活菌计数法测定较脏的水样？n n减少滤液体积、无菌水稀释减少滤液体积、无菌水稀释减少滤液

18、体积、无菌水稀释减少滤液体积、无菌水稀释(三三)重量法重量法（测细胞的质量）（测细胞的质量）n n提问：已知什么条件提问：已知什么条件提问：已知什么条件提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？通过测定细菌群体重量知道其数量？通过测定细菌群体重量知道其数量？通过测定细菌群体重量知道其数量？n n已知已知已知已知单个细菌的平均重量单个细菌的平均重量单个细菌的平均重量单个细菌的平均重量 除法计算除法计算除法计算除法计算n n细菌的细菌的细菌的细菌的湿湿湿湿重量重量重量重量1010-15-151010-11-11g/g/个细胞个细胞个细胞个细胞n n干重约为干重约为干重约为干重约为湿重的湿重

19、的湿重的湿重的10102020。n n1.干重法干重法n n方法：方法：含菌水样在含菌水样在含菌水样在含菌水样在105105110110下进行干燥恒重下进行干燥恒重下进行干燥恒重下进行干燥恒重（本质测本质测本质测本质测水中悬浮物重量水中悬浮物重量水中悬浮物重量水中悬浮物重量MLSSMLSS或或或或MLVSSMLVSS）。2.细胞含细胞含N量法量法3.DNA含量法含量法 4.其它生理生化指标法其它生理生化指标法Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Volatile Suspended So

20、lids Mixed Liquor Volatile Suspended Solids n n悬浮物无机物悬浮物无机物悬浮物无机物悬浮物无机物+有机物（包括细菌）有机物（包括细菌）有机物（包括细菌）有机物（包括细菌）n n提提提提问问问问：如如如如何何何何确确确确定定定定悬悬悬悬浮浮浮浮物物物物中中中中有有有有机机机机物物物物与与与与无无无无机机机机物物物物的的的的量量量量？n n高温高温高温高温(550(550)灼烧灼烧灼烧灼烧 n n无机物化学性质稳定，高温下不会分解无机物化学性质稳定，高温下不会分解无机物化学性质稳定，高温下不会分解无机物化学性质稳定，高温下不会分解n n提提提提问问问问

21、：什什什什么么么么情情情情况况况况下下下下可可可可以以以以直直直直接接接接用用用用悬悬悬悬浮浮浮浮物物物物的的的的重重重重量量量量表表表表示细菌的重量？示细菌的重量？示细菌的重量？示细菌的重量？n n悬浮物中绝大多数是细菌。n n干重法干重法 （1）悬浮物中绝大多数为细菌时）悬浮物中绝大多数为细菌时n n细胞数目细胞数目细胞数目细胞数目=MLSS=MLSS个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量离心沉淀离心沉淀 滤膜过滤滤膜过滤计算计算105110下进行干燥下进行干燥恒重恒重恒重恒重称重称重或或或或MLSSMLSS悬浮物悬浮物悬浮物悬浮物（2）除细菌外还

22、有大量无机悬浮物时）除细菌外还有大量无机悬浮物时n n WWWW无无n nMLMLV VSSSS挥发性悬浮物挥发性悬浮物挥发性悬浮物挥发性悬浮物MLSSMLSS WW无无 =细菌群体的干重量细菌群体的干重量细菌群体的干重量细菌群体的干重量n n细胞数目细胞数目细胞数目细胞数目=MLMLV VSSSS 个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量 550下灼烧下灼烧2h称重称重105110下进下进行干燥恒重行干燥恒重称重称重MLSS（3）有大量）有大量非细菌有机悬浮物非细菌有机悬浮物时时n n提问：提问：如何测定呢？如何测定呢？n n不能用重量法，应改用其他方

23、法。不能用重量法，应改用其他方法。不能用重量法，应改用其他方法。不能用重量法，应改用其他方法。n总总体体来来说说重重量量法法方方法法误误差差较较大大，一般只作为菌数粗略估算一般只作为菌数粗略估算n如如活活性性污污泥泥测测定定（以以重重量量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量间接表示细菌数量）n n提提提提问问问问：当当当当你你你你需需需需要要要要测测测测定定定定某某某某水水水水样样样样中中中中细细细细菌菌菌菌数数数数量量量量时时时时，你你你你该该该该如何选择方法？如何选择方法？如何选择方法？如何选择方法？视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取