第八章-病毒的一般研究方法与技术-病毒学课件.ppt
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1、1第八章 病毒的一般研究方法与技术2p第一节 病毒培养 p第二节 病毒的分离纯化与测定 p第三节 病毒的鉴定3第一节 病毒培养 病毒培养在病毒学研究中除用做病毒增殖、病原分离以外,还用于研究病毒的复制过程及细胞的病理变化,研究病毒与宿主的互作关系,探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制等。还可用于病毒的分离鉴定、抗原的制备、疫苗和干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。4一、活体培养p动物实验法是最原始的病毒培养方法。p常用实验动物有小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔、猴等。p根据不同病毒对组织的亲嗜性而定,可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉。(一)动物实验法6根据病毒的特性可分别接种在
2、尿囊腔接种;羊膜腔接种;鸡胚绒毛尿囊膜接种;卵黄囊接种等等。78鸡胚培养优缺点 比用动物更加经济简便;鸡胚的组织分化程度低,病毒易于繁殖;鸡胚和实验动物一样,为正在发育中的机体,有神经血管的分布及脏器的结构;鸡胚来源充足,操作简便,本身很少带病毒,是无菌的,对接种的病毒不产生抗体。p可能含有家禽病毒的母源抗体;可能携带垂直传播的病原体;很多病毒在鸡胚中不生长。p鸡胚常用于流感病毒、腮腺炎病毒等的分离培养。10(一)细胞培养病毒的优点p没有隐性感染:细胞培养来源于动物的部分组织,可通过预先检查组织避免隐性感染 p没有免疫力:离体培养的细胞无免疫力,可利于病毒的生长。p容易选择易感细胞:细胞来源方
3、便,可选择最敏感的细胞以满足实验要求。p易于获得大量病毒:动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制,而细胞不仅可以大量生产,还可持久地续培养。p培养条件易于控制:可用人工控制温度、气体、pH、培养基成分,大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。p提高了疫苗的产量和质量:细胞大量生产可满足疫苗产量的需求;可减少疫苗污染菌,随制随用,成本低,来源方便,便于储存,效力稳定,易标准化生产。p病毒分离容易:采用细胞培养可显著加速病毒的分离过程。11p199培养基(Eagle平衡盐溶液)几乎包含所有氨基酸、维生素及一些核酸中间代谢产物和辅助生长因子等,主要用于原代细胞的生长,使用时加上0.5%10%
4、的胎牛血清,营养更丰富。pMEM培养基(带有Earle平衡盐溶液)含有对哺乳类细胞生长必需的最低限度的维生素和氨基酸,用于原代细胞的维持和生长。加10%胎牛血清,用于最初的细胞生长。加0.5%2%的胎牛血清可用于细胞的维持。pEBM培养基(用Earle平衡盐溶液配制的Eagle基础培养基)其中的氨基酸和维生素的含量均较MEM培养基有所增加,通常加上0.5%10%的FCS,用于二倍体或传代细胞的维持和生长。pLeibovltz 15培养液(L-15培养液)这是一种人工综合培养液,其中不加葡萄糖而用半乳糖作为能源,因此不需要CO2缓冲系统。此外,L-15培养液内含有过量的氨基酸,有些带有自由碱基,
5、可长期维持细胞培养。(二)细胞培养基细胞培养基因细胞类型和细胞培养的用途不同而异。1315传代细胞 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来(如Hela、Hep-2、Vero细胞系等),染色体数为非整倍体,细胞生长迅速,可无限传代,在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作,根据病毒对细胞的亲嗜性,选择敏感的细胞系使用。16第二节 病毒的分离纯化与测定 病毒的分离纯化与定量测定是病毒学研究的基本技术。通过病毒的分离纯化,可获得纯化的、有感染性的病毒制备物。通过病毒测定可确定病毒数量及活性。病毒分离是将疑有病毒而待分离的标本经处理后,接种于相应敏感的宿主、鸡胚或感染细胞,培养一段时间后,通过
6、检查不同病毒的特异性表现确定病毒的存在,并对病毒进行提取和纯化。18病毒的接种 动物病毒标本可接种于实验动物、鸡胚和易感的培养细胞。植物病毒可接种于敏感的植物叶片。噬菌体标本可接种于生长在培养液或营养琼脂平板中的细菌培养物 标本接种于何种实验宿主(动物、植物、细菌、鸡胚、细胞)以及选择何种接种途径,主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性。19病毒的感染症状 n动物病毒感染敏感细胞培养能引起细胞病变效应(成团、肿大、圆缩、脱落、细胞融合形成多核细胞,细胞内出现包涵体)。n细胞单层培养上形成肉眼可见的局部病损区域,称蚀斑或空斑。20猴肾细胞猴肾细胞+poliovirus猴肾细胞+HSV21p植物病毒感
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