生物制品分析llq.ppt

《生物制品分析llq.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物制品分析llq.ppt（60页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、生物制品分析概论生物制品分析概论生物制品生物制品:以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成。为原料，应用传统技术或现代生物技术制成。（一）疫苗类（一）疫苗类（二）抗病毒及抗毒血清类药物（免疫血清类）（二）抗病毒及抗毒血清类药物（免疫血清类）（三）血液制品（三）血液制品（四）重组（四）重组DNA制品制品（五）诊断制品（五）诊断制品第一节第一节 生物制品的种类生物制品的种类（一）疫苗类（一）疫苗类用用病毒病毒或或立克次体立克次体接种于动物、鸡胚，或经接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。组织培养后加以处理制造而成

2、。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病生理物质、特殊抗体等；当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。1、细菌类疫苗、细菌类疫苗2、病毒类疫苗、病毒类疫苗3、联合疫苗、联合疫苗4、双价

3、疫苗及多价疫苗、双价疫苗及多价疫苗（一）疫苗类（一）疫苗类 1、细菌类疫苗、细菌类疫苗 由由有有关关细细菌菌、螺螺旋旋体体或或其其衍衍生生物物制制成成的的减减毒毒活活疫疫苗苗、灭灭活活疫疫苗苗、重重组组DNA疫疫苗苗、亚亚单单位疫苗。位疫苗。皮皮内内注注射射用用卡卡介介苗苗、伤伤寒寒Vi多多糖糖疫疫苗苗、吸吸附附破破伤伤风风疫疫苗苗、乙乙型型脑脑炎炎灭灭活活疫疫苗苗、乙乙型型脑脑炎减毒活疫苗、人用狂犬疫苗等。炎减毒活疫苗、人用狂犬疫苗等。（一）疫苗类（一）疫苗类 2、病毒类疫苗、病毒类疫苗 由由病病毒毒、衣衣原原体体、立立克克次次体体或或其其衍衍生生物物制制成成的的减减毒毒活活疫疫苗苗、灭灭活

4、活疫疫苗苗、重重组组DNA疫苗、亚单位疫苗。疫苗、亚单位疫苗。口口服服脊脊髓髓灰灰质质炎炎减减毒毒活活疫疫苗苗、麻麻疹疹减减毒毒活活疫疫苗苗、风风疹疹减减毒毒活活疫疫苗苗、腮腮腺腺炎炎减减毒毒活活疫苗等。疫苗等。3、联合疫苗、联合疫苗 两两种种或或两两种种以以上上疫疫苗苗原原液液按按特特定定比比例例配配制制成成的的具具有有多多种种免免疫疫原原性性的的灭灭活疫苗或活疫苗。活疫苗或活疫苗。伤伤寒寒副副伤伤寒寒甲甲乙乙联联合合疫疫苗苗、吸吸附附百百白白破破联联合合疫疫苗苗、麻麻疹疹腮腮腺腺炎炎联联合合减减毒疫苗等。毒疫苗等。4、双价疫苗及多价疫苗、双价疫苗及多价疫苗 两两种种或或两两种种以以上上同同

5、一一种种但但不不同同型型（或或群群）抗抗原原合合并组成的疫苗。并组成的疫苗。双价肾综合症出血热灭活疫苗等。双价肾综合症出血热灭活疫苗等。（二）（二）抗毒素及抗毒血清（抗毒素及抗毒血清（免疫血清类）免疫血清类）l抗毒素（抗毒血清）：用细菌类毒素或毒素免疫抗毒素（抗毒血清）：用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的马或其他大动物所取得的免疫血清免疫血清 破伤风抗毒素、白喉抗毒素和肉毒抗毒素等破伤风抗毒素、白喉抗毒素和肉毒抗毒素等（二）免疫血清类（二）免疫血清类l抗菌（抗病毒）血清：用细菌、病毒本身免抗菌（抗病毒）血清：用细菌、病毒本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清疫马或其他大动物所取得的免

6、疫血清 抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清、抗炭疽血清、蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清、抗炭疽血清、抗狂犬病血清抗狂犬病血清l持续时间短，主要用治疗和紧急预防持续时间短，主要用治疗和紧急预防（三）血液制品（三）血液制品 由健康人的血由健康人的血浆浆或经特异免疫或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。及血液细胞有形成分。人血白蛋白、人免疫球蛋白、人血白蛋白、人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白等。乙型肝炎人免疫球蛋白等。（四）重组（四

7、）重组DNA制品制品 （四）重组（四）重组DNA制品制品 1、细胞因子类：重组人干扰素等、细胞因子类：重组人干扰素等 2、生长因子类：重组人表皮生长因子等、生长因子类：重组人表皮生长因子等 3、激素类：重组人生长激素等、激素类：重组人生长激素等 4、酶类：注射用重组链激酶等、酶类：注射用重组链激酶等 5、疫苗：重组乙型肝炎疫苗等、疫苗：重组乙型肝炎疫苗等 6、单克隆抗体：注射用抗人、单克隆抗体：注射用抗人T细胞细胞CD3鼠单抗鼠单抗（五）诊断制品（五）诊断制品 用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品。的制品。毒素、诊断血清、分型血清和因子血清等。毒素

8、、诊断血清、分型血清和因子血清等。分为：分为：1 1、体外诊断制品、体外诊断制品 2 2、体内诊断制品、体内诊断制品（一）需进行相对分子质量的测定（一）需进行相对分子质量的测定 大大部部分分为为大大分分子子物物质质（如如蛋蛋白白质质、多多肽肽、核核酸酸、多多糖糖类类等等），其其相相对对分分子子质质量量一一般般为为几几千千至至几几十十万万。对对大大分分子子的的生生物物制制品品而而言言，即即使使组组分分相相同同，往往往往由由于于相相对对分分子子质质量量不不同同而而产产生生不不同同的的生生理理活活性性。所所以以，生生物物制制品品常常需需进进行行相相对分子质量的测定。对分子质量的测定。一、生物制品分析

9、的特点一、生物制品分析的特点第二节第二节 生物制品分析特点及质量要求生物制品分析特点及质量要求（二）需检查生物活性（二）需检查生物活性 在在制制备备多多肽肽或或蛋蛋白白质质类类药药物物时时，有有时时因因工工艺艺条条件件的的变变化化，导导致致活活性性多多肽肽或或蛋蛋白白质质失失活活。因因此此，对对这这类类生生物物制制品品除除了了用用通通常常采采用用的的理理化化法法检检验验外外，尚尚需需用用生生物物检检定定法法进进行行检检定定，以以证证实其生物活性。实其生物活性。（三）需做安全性检查（三）需做安全性检查 由由于于生生物物制制品品的的性性质质特特殊殊，生生产产工工艺艺复复杂杂，易易引引入入特特殊殊杂

10、杂质质，故故生生物物制制品品常常需需做做安安全全性性检检查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。查，如热原检查、过敏试验、异常毒性试验等。（四）需做效价测定（四）需做效价测定 生生化化制制品品多多数数可可通通过过含含量量测测定定，以以表表明明其其主主药药的的含含量量。但但对对某某些些药药物物需需进进行行效效价价测测定定或或酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。酶活力测定，以表明其有效成分含量的高低。（五）要用生化法确证结构（五）要用生化法确证结构 在在大大分分子子生生物物药药物物中中，由由于于有有效效结结构构或或相相对对分分子子质质量量不不确确定定，其其结结构构的的确确证证很很难难沿沿用用

11、元元素素分分析析、红红外外、紫紫外外、核核磁磁、质质谱谱等等方方法法加加以以证证实实，往往往往还还要要用用生生化化法法如如氨氨基基酸酸序序列列分分析析等等方法加以证实。方法加以证实。（一）来源于生物体（一）来源于生物体（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（三）工艺存在易变性和安全性问题（三）工艺存在易变性和安全性问题二、生物制品生产的特点二、生物制品生产的特点危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染全程质量控制：原材料、生产过程、最终产品全程质量控制：原材料、生产过程、最终产品 （1）严格遵守）严格遵守GMP标

12、准标准 （2）建立完善的制造检定规程）建立完善的制造检定规程 （3）建建立立各各生生产产工工序序相相适适应应的的检检定定方方法法、标标准操作细则（准操作细则（SOP）三、生物制品的全程质量控制三、生物制品的全程质量控制中华人民共和国药典中华人民共和国药典（2010版三部）项目：版三部）项目：1.品名（中文通用名称、英文名称、汉语拼音）品名（中文通用名称、英文名称、汉语拼音）2.定义、组成及用途定义、组成及用途 3.基本要求基本要求 4.制造制造 5.检定（原液、半成品、成品）检定（原液、半成品、成品）6.保存运输及有效期保存运输及有效期 7.使用说明（仅预防类含此项）使用说明（仅预防类含此项）

13、生物制品质量控制的重点：生物制品质量控制的重点：（一）有效成分的同一性、结构确证（一）有效成分的同一性、结构确证（二）有效成分的均一性、纯度检验（二）有效成分的均一性、纯度检验（三）有害物质及残余杂质的控制（三）有害物质及残余杂质的控制（四）高效、灵敏的生物活性及比活性实验方法（四）高效、灵敏的生物活性及比活性实验方法生物制品的质量标准有别于其他商品，生物制品的质量标准有别于其他商品，强调其特殊性：强调其特殊性：1、安全性：安全使用，副作用小、安全性：安全使用，副作用小2、有效性：使用后能产生相应的效力、有效性：使用后能产生相应的效力3、可接受性、可接受性生物制品质量控制的基本内容：生物制品质

14、量控制的基本内容：（一）鉴别试验（一）鉴别试验（二）杂质检查（二）杂质检查（三）安全性检查（三）安全性检查（四）含量（生物学活性或效价）测定（四）含量（生物学活性或效价）测定（一）免疫学法（一）免疫学法 抗原抗体反应检测新技术：抗原抗体反应检测新技术：（1）免疫双扩散法）免疫双扩散法 凝凝胶胶中中进进行行的的固固相相沉沉淀淀反反应应。抗抗原原抗抗体体在在琼琼脂脂凝凝胶胶中中扩扩散散，由由近近及及远远形形成成梯梯度度，当当两两者者在在比比例例适适当当处处相相遇遇，发发生生反反应应，反反应应的的沉沉淀淀物物因因其其颗颗粒较大，在凝胶中不再扩散，形成沉淀带。粒较大，在凝胶中不再扩散，形成沉淀带。第三

15、节第三节 鉴别试验鉴别试验（2）免疫电泳法）免疫电泳法 琼琼脂脂平平板板电电泳泳和和双双相相免免疫疫扩扩散散两两种种方方法法的的结结合合。将将抗抗原原样样品品在在琼琼脂脂平平板板上上先先进进行行电电泳泳，使使其其中中的的各各种种成成分分因因电电泳泳迁迁移移率率的的不不同同而而彼彼此此分分开开，然然后后加加入入抗抗体体做做双双相相免免疫疫扩扩散散，当当两两者者在在比比例例适适当当处处相相遇遇，发生反应，形成沉淀弧。发生反应，形成沉淀弧。迁移率、分子量迁移率、分子量 （3）免疫印迹法（）免疫印迹法（Western blot）经经过过PAGE分分离离的的蛋蛋白白质质样样品品，转转移移到到固固相相载载

16、体体（如如硝硝酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜）上上。以以固固相相载载体体上上的的蛋蛋白白质质作作为为抗抗原原，与与对对应应的的抗抗体体起起免免疫疫反反应应，再再与与酶酶或或同同位位素素标标记记的的第第二二抗抗体体起起反反应应，经经过过底底物物显显色色或或放放射射自自显显影影，对对供供试试品品的的抗抗原原特异性进行检查。特异性进行检查。n n（4）免疫斑点法）免疫斑点法n n（5）酶联免疫法）酶联免疫法:利利利利用用用用酶酶酶酶标标标标记记记记抗抗抗抗原原原原（抗抗抗抗体体体体），通通通通过过过过酶酶酶酶促促促促显显显显色色色色反反反反应应应应，可可可可以以以以直直直直接接接接观观观观察察察察特特特特

17、征征征征颜颜颜颜色色色色变变变变化化化化来来来来测测测测定定定定抗抗抗抗体体体体（抗原）。（抗原）。（抗原）。（抗原）。（二）肽图分析（二）肽图分析 根根据据蛋蛋白白质质、多多肽肽的的分分子子量量大大小小以以及及氨氨基基酸酸组组成成特特点点，使使用用专专一一性性较较强强的的蛋蛋白白水水解解酶酶（一一般般为为肽肽链链内内切切酶酶）作作用用于于特特殊殊的的肽肽链链位位点点将将多多肽肽裂裂解解成成小小片片断断，通通过过一一定定的的分分离离检检测测手手段段形形成成特特征征性性指指纹纹图图谱。谱。l溴化氰裂解溴化氰裂解-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）l胰蛋白裂解胰蛋白裂解-反

18、相高效液相色谱（反相高效液相色谱（RP-HPLC）l胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解-毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）结结合合N-末末端端氨氨基基酸酸序序列列分分析析，是是蛋蛋白白质质类类生生物物制品精确的鉴别方法制品精确的鉴别方法（一）来源于生物体（一）来源于生物体（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（二）制造过程涉及生物材料和生物学特征（三）工艺存在易变性和安全性问题（三）工艺存在易变性和安全性问题生物制品生产的特点生物制品生产的特点生生物物制制品品危危险险因因素素：异异源源物物质质、不不稳稳定、易受微生物污染定、易受微生物污染第四节第四节 生物制品检查内容生物制品检查内容一、理化检定一

19、、理化检定（一）物理性状检查（一）物理性状检查（二）蛋白质含量测定（二）蛋白质含量测定（三）防腐剂和灭活剂（三）防腐剂和灭活剂（四）纯度检查（四）纯度检查（五）相对分子质量或分子大小测定（五）相对分子质量或分子大小测定二、安全检查二、安全检查（一）安全检查对象1.菌毒种和原材料2.半成品3.成品 （一）过敏性物质检查（一）过敏性物质检查 （二）杀毒、灭活和脱毒检查（二）杀毒、灭活和脱毒检查 （三）毒性物质检查（三）毒性物质检查 （四）（四）外源性污染检查外源性污染检查（二）、安全性检查内容（二）、安全性检查内容过敏反应检查：过敏反应检查：检查异性蛋白检查异性蛋白 豚鼠试验法豚鼠试验法 毒毒性性

20、检检查查：疫疫苗苗类类生生物物制制品品是是否否存存在在自自身身毒毒素素引引起起的特异性毒性的不安全因素的特异性毒性的不安全因素 小鼠试验法小鼠试验法 豚鼠试验法豚鼠试验法外外源源性性污污染染检检查查：是是否否污污染染外外源源性性毒毒性性物物质质以及是否存在意外的不安全因素以及是否存在意外的不安全因素三、效力测定三、效力测定n n1.免疫力试验免疫力试验n n2.活菌数和活病毒滴度测定活菌数和活病毒滴度测定n n3.血清学试验血清学试验3.血清学法血清学法 体外抗原抗体试验体外抗原抗体试验 经典血清学反应：经典血清学反应：（1）凝集反应）凝集反应 （2）沉淀反应）沉淀反应 （3）补体结合反应）补

21、体结合反应 （4）中和反应）中和反应经典血清学反应：经典血清学反应：（1）凝集反应）凝集反应 颗颗粒粒性性抗抗原原（完完整整的的病病原原微微生生物物或或红红细细胞胞等等）与与相相应应抗抗体体结结合合，在在有有电电解解质质存存在在的的条条件件下下，经经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。（2）沉淀反应）沉淀反应 可可溶溶性性抗抗原原与与相相应应的的抗抗体体混混合合，在在电电解解质质存存在在的的条条件件下下，两两者者比比例例适适合合，即即可可有有沉沉淀淀物物出出现现。沉沉淀淀反反应应抗抗原原多多系系胶胶体体溶溶液液，沉沉淀淀物物主主要要是是由由抗抗体体蛋蛋白白所

22、所组成。组成。（3）补体结合反应补体结合反应 可溶性抗原与相应抗体结合后，抗原抗可溶性抗原与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，加入红细胞和溶血素，即可根不能察觉，加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。否存在相应的抗原或抗体。（4）中和反应）中和反应 抗体与病毒或毒素结合，使病毒或毒素抗体与病毒或毒素结合，使病毒或毒素失去致病力或毒性。失去致病力或毒性。一、一般杂质检查一、一般杂质检查二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查三、安全性检查三、安全性检查

23、杂质检查杂质检查 检检查查项项目目：氯氯化化物物、硫硫酸酸盐盐、铵铵盐盐、铁铁盐盐、重重金金属属、酸酸碱碱度度、溶溶液液的的澄澄清清度度与与颜颜色色、水水分分及及干干燥燥失重、炽灼残渣等。失重、炽灼残渣等。检查方法：同化学药物检查方法：同化学药物一、一般杂质检查一、一般杂质检查检查意义：检查意义：（1）特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题）特殊杂质可能存在的毒性会引起安全性问题 （2）可能影响产品的生物学活性和药理作用）可能影响产品的生物学活性和药理作用 （3）反映产品生产工艺的稳定性）反映产品生产工艺的稳定性 主要特殊杂质主要特殊杂质：生物污染物、产品相关杂质、工艺添加剂生物污染物、产品相

24、关杂质、工艺添加剂二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 主要特殊杂质主要特殊杂质：生物污染物生物污染物 （1）微生物）微生物 （2）细胞成分）细胞成分 （3）培养基成分）培养基成分 （4）有关大分子物质）有关大分子物质二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查宿主细胞、外源性宿主细胞、外源性DNA牛血清白蛋白牛血清白蛋白重组制品重组制品中的鼠中的鼠IgG 主要特殊杂质主要特殊杂质：产品相关杂质产品相关杂质 （1）二聚体和多聚体）二聚体和多聚体 （2）脱氨或氧化产物）脱氨或氧化产物 （3）突变物）突变物 （4）错误裂解产物）错误裂解产物 （5）二硫化物异构体）二硫化物异构体二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 主

25、要特殊杂质主要特殊杂质：工艺添加剂工艺添加剂 （1）残余抗生素）残余抗生素 （2）蛋白分离剂（聚乙二醇、乙醇）蛋白分离剂（聚乙二醇、乙醇）（3）佐剂氢氧化铝）佐剂氢氧化铝 （4）产品稳定剂（辛酸钠、肝素）产品稳定剂（辛酸钠、肝素）（5）防腐剂（苯酚、硫柳汞等）防腐剂（苯酚、硫柳汞等）（6）细菌与病毒灭活剂（甲醛等）细菌与病毒灭活剂（甲醛等）二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 （一）宿主细胞蛋白残留量的检查（一）宿主细胞蛋白残留量的检查 检检查查目目的的：控控制制异异源源蛋蛋白白的的含含量量，以以防防超超量量后后引引起机体免疫反应起机体免疫反应 检查方法：酶联免疫吸附剂测定法检查方法：酶联免疫吸附

26、剂测定法ELISA 二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 （二）外源性（二）外源性DNA残留量的检查残留量的检查 检查目的：防止外源性检查目的：防止外源性DNA对人类的危害对人类的危害 检检查查方方法法：分分子子杂杂交交技技术术、基基于于DNA结结合合蛋蛋白白的的分析技术、实时定量分析技术、实时定量PCR技术技术 二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 分分子子杂杂交交技技术术：基基于于碱碱基基互互补补原原理理，利利用用核核酸酸探针与被测定单链基因序列杂交进行检测。探针与被测定单链基因序列杂交进行检测。（1）菌落原位杂交）菌落原位杂交 （2）Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blot

27、）（3）Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blot）基基于于DNA结结合合蛋蛋白白分分析析系系统统：生生物物素素-DNA单单链链结结合合蛋蛋白白、尿尿素素酶酶-抗抗ssDNA单单抗抗与与变变性性的的DNA结结合合；通通过过亲亲和和素素连连接接到到生生物物素素-硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜；尿素酶催化尿素分解成尿素酶催化尿素分解成NH3和和CO2；测定；测定pH。实时定量实时定量PCR：（三）产品相关杂质的检查（三）产品相关杂质的检查 检查对象：同系物、异构体、降解产物等检查对象：同系物、异构体、降解产物等 检查方法：高效液相色谱法、电泳法检查方法：高效液相色谱法、电泳法 二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查 （四）残余抗生素的检查（四）残余抗生素的检查 检查目的：控制生物制品制备时抗生素的用量检查目的：控制生物制品制备时抗生素的用量 检查方法：抑菌试验检查方法：抑菌试验 二、特殊杂质检查二、特殊杂质检查