第九章植物原生质体培养与体细胞杂交课件.ppt

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1、第九章第九章 植物原生质体培养植物原生质体培养与体细胞杂交与体细胞杂交v 原生质体培养的意义原生质体培养的意义第一节第一节 原生质体的分离与纯化原生质体的分离与纯化第二节第二节 影响原生质体产量和活力的因素影响原生质体产量和活力的因素第三节第三节 原生质体的培养原生质体的培养第四节第四节 由原生质体再生植株由原生质体再生植株第五节第五节 体细胞杂交体细胞杂交第六节第六节 原生质体的原生质体的v 原生质体培养的意义原生质体培养的意义1、原生质体原生质体的特性的特性（1）去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入）去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。和吸收。（2）原生质体具有细胞全能性。

2、）原生质体具有细胞全能性。（3）不同来源的原生质体具有）不同来源的原生质体具有彼此融合彼此融合的能力。的能力。2、原生质体培养应用、原生质体培养应用（1）克服植物有性杂交的障碍，扩大物种间遗传物）克服植物有性杂交的障碍，扩大物种间遗传物质交流的范围，创造有利变异，培育新品种。质交流的范围，创造有利变异，培育新品种。（2）作为独特的实验系统，用于体细胞遗传、生理、）作为独特的实验系统，用于体细胞遗传、生理、病理等方面的基础理论研究。病理等方面的基础理论研究。第一节第一节 原生质体的分离与纯化原生质体的分离与纯化一、原生质体的分离一、原生质体的分离（一）（一）分离原生质体的材料来源分离原生质体的材

3、料来源（二）（二）分离方法分离方法 1机械分离法机械分离法 2酶法分离酶法分离（三）（三）技术程序技术程序二、二、原生质体的纯化原生质体的纯化（一）分离原生质体的材料来源（一）分离原生质体的材料来源游游离离原原生生质质体体时时，植植物物叶叶片片、花花瓣瓣、果果实实组组织织、子子叶叶、下下胚胚轴轴、幼幼根根、茎茎叶叶、愈愈伤伤组组织织、悬悬浮浮细细胞胞等等都都可可作作为材料来源，但常用于分离原生质体的材料为：为材料来源，但常用于分离原生质体的材料为：1、叶片、叶片叶叶片片来来源源丰丰富富，供供应应及及时时，有有明明显显的的叶叶绿绿体体存存在时也便于在细胞融合中识别。在时也便于在细胞融合中识别。2

4、、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料3、愈伤组织或悬浮培养细胞。、愈伤组织或悬浮培养细胞。（1）分离原生质体的酶类）分离原生质体的酶类酶的类型酶的类型作用作用常用种类常用种类纤维素酶纤维素酶降解细胞壁中纤维素成分，降解细胞壁中纤维素成分，游离原生质体。游离原生质体。Onozuka R-10 半纤维素酶半纤维素酶降解细胞壁中的半纤维素降解细胞壁中的半纤维素成分。成分。Phozyme HP-150 果胶酶果胶酶降解相邻细胞间的果胶质，降解相邻细胞间的果胶质，使细胞游离。使细胞游离。Macerozyme R-10（2）酶解分离原生质体的方法酶解分离原生质体的方法两

5、步分离法两步分离法这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。一步分离法一步分离法即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理，处理温度对材料进行一次性处理，处理温度2530，处理的，处理的时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为224h。二、原生质体的二、原生质体的纯化纯化（一）（一）离心沉淀法离

6、心沉淀法(过滤浓缩法）过滤浓缩法）（二）（二）接口法接口法 选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体经适当速度离心后即介于两质体的密度，原生质体经适当速度离心后即介于两种溶液之间。种溶液之间。（二）漂浮法（二）漂浮法 （二）接口法（二）接口法1、方法：、方法：先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（21%21%），再小），再小心的加入过滤处理的酶心的加入过滤处理的酶-原生质体混合液，以合适的速度离心，原生质体混合

7、液，以合适的速度离心，原生质体将原生质体将聚集于两液面之间聚集于两液面之间。小心取出原生质体转入另一。小心取出原生质体转入另一离心管，用清洗介质清洗、离心，重复离心管，用清洗介质清洗、离心，重复3 3次。最后以适当的密次。最后以适当的密度悬浮于液体培养基中。度悬浮于液体培养基中。2、优劣、优劣该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度，用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度，使原生质体漂浮于单一界面，且不影响

8、原生质体的稳定性和使原生质体漂浮于单一界面，且不影响原生质体的稳定性和活力。活力。第二节第二节 影响原生质体产量影响原生质体产量和活力的因素和活力的因素一、材料来源一、材料来源（一）（一）植物叶片植物叶片（二）（二）培养细胞培养细胞二、二、预处理预处理 三、三、酶处理酶处理四、四、渗透压渗透压（一）（一）植物叶片植物叶片当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。、植株年龄、植株年龄 对一年生草本：生长对一年生草本：生长40-60天的幼叶；天的幼叶；对多年生木本：幼龄

9、且充分展开的叶片。对多年生木本：幼龄且充分展开的叶片。、母株生长环境、母株生长环境母株生长在低光强（母株生长在低光强（10001x）、短日照、温度）、短日照、温度2025、相对湿度、相对湿度6080的条件下，以及较的条件下，以及较高的氮肥供应。高的氮肥供应。、采用离体苗叶片、采用离体苗叶片（二）培养细胞（二）培养细胞由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养细胞的生长速率和生长时期。细胞的生长速率和生长时期。频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以处于对数生长早期的细胞为好。即：处于对数生长早期的细胞为好。即：频繁继

10、代（每频繁继代（每23天继代天继代1次）的悬浮培养物以次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。及处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细胞壁的再生和细胞的分裂和分化。胞壁的再生和细胞的分裂和分化。不同植物适宜于分离原生质体的材料不同植物适宜于分离原生质体的材料不同科属的植物其材料特性存在差异，适宜于游离原不同科属的植物其材料特性存在差异，适宜于游离原生质体的供体材料也异。生质体的供体材料也异。（1）茄科）茄科一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼嫩叶一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开

11、的幼嫩叶片。片。（2）十字花科）十字花科种子萌发种子萌发4-5天的无菌苗的下胚轴为材料，具有原生质天的无菌苗的下胚轴为材料，具有原生质体得率高、活力强、再生频率高等优点。体得率高、活力强、再生频率高等优点。（3）豆科）豆科以未成熟种子的子叶为材料。以未成熟种子的子叶为材料。（4）禾本科）禾本科用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体建立胚性愈伤用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体。组织及其胚性悬浮细胞系分离原生质体。二、预处理二、预处理1、依据材料特性进行表面灭菌、依据材料特性进行表面灭菌2、促使酶液渗入组织细胞内的措施、促使酶液渗入组织细胞内的措施（1）

12、撕去叶片的下表皮，将无表皮的一面向撕去叶片的下表皮，将无表皮的一面向下漂浮在酶溶液中。下漂浮在酶溶液中。（2）将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片，将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片，投入到酶溶液中。投入到酶溶液中。（3 3）真空渗入促使酶液渗透。）真空渗入促使酶液渗透。（4 4）酶处理期间进行搅拌或振荡。）酶处理期间进行搅拌或振荡。1 1、酶种类、处理浓度、处理时间、酶种类、处理浓度、处理时间（1）对于胚性愈伤组织、悬浮培养细胞）对于胚性愈伤组织、悬浮培养细胞常用活性较强的酶的组合，如常用活性较强的酶的组合，如Cellulase RS、Pectolyase Y-23、Rhozyme HP150，并

13、且酶处理浓度应高些，并且酶处理浓度应高些，用量应大些。用量应大些。（2）对于叶片、子叶、下胚轴等材料）对于叶片、子叶、下胚轴等材料常用常用Cellulase R-10、Macerozyme R-10、Hemicellulase等活性属一般的酶，酶处理浓度可低些，用量等活性属一般的酶，酶处理浓度可低些，用量少一些。少一些。（3）酶解时间）酶解时间视材料、酶性质、处理浓度而定，视材料、酶性质、处理浓度而定，30min-24h。一般不。一般不宜超过宜超过24小时，以免游离的原生质体解体。小时，以免游离的原生质体解体。四、渗透压四、渗透压离体原生质体的一个基本属性是它们的渗透破离体原生质体的一个基本属

14、性是它们的渗透破碎性。所以在原生质体分离和最初培养阶段，应给碎性。所以在原生质体分离和最初培养阶段，应给予渗透压保护，以代替细胞壁对原生质体机械维持予渗透压保护，以代替细胞壁对原生质体机械维持的压力。的压力。（一）（一）渗透压保护剂渗透压保护剂（二）（二）应注意的问题应注意的问题（一）渗透压保护剂（一）渗透压保护剂原原生生质质体体分分离离及及培培养养过过程程中中渗渗透透压压的的调调节节通通常常利用糖或糖醇来控制，利用糖或糖醇来控制，常常用用的的渗渗压压剂剂有有甘甘露露醇醇、山山梨梨醇醇、葡葡萄萄糖糖和和蔗蔗糖糖，其其中中甘甘露露醇醇和和山山梨梨醇醇或或其其组组合合最最常常用用。叶叶原原生生质质

15、 体体 分分 离离 时时 最最 常常 用用 的的 为为 甘甘 露露 醇醇（浓浓 度度 为为0.230.90M）。）。有有效效的的渗渗透透浓浓度度决决定定于于原原生生质质体体分分离离期期间间叶叶细细胞胞的的渗渗透透压压。内内源源细细胞胞渗渗透透压压明明显显地地受受环环境境条条件件的的影影响响，并并且且能能够够用用暗暗处处理理植植株株和和幼幼叶叶组组织织等等措措施施加加以控制。以控制。第三节第三节 原生质体的培养原生质体的培养一、影响原生质体培养的因素一、影响原生质体培养的因素（一）（一）基本培养基基本培养基（二）（二）渗透压渗透压（三）（三）植物激素植物激素（四）（四）氮源氮源（五）（五）复杂有

16、机物复杂有机物二、二、培养方法培养方法三、三、培养密度培养密度四、四、培养条件培养条件（一）基本培养基（一）基本培养基1、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且、所使用的培养基一般是改良的细胞培养基，并且培养基的基础成分多采用培养基的基础成分多采用B5或或MS培养基的配方。如培养基的配方。如 KM8P和和K8P培养基：培养基：以以B5培养基为基础培养基为基础NT培养基：培养基：以以MS培养基为基础培养基为基础2、不同植物常采用的培养基、不同植物常采用的培养基禾本科植物：禾本科植物：MS、N6、KM；十字花科和豆科：十字花科和豆科：B5、KM8P、K8P、KM；茄科：茄科：MS、NT、K3（

17、三）植物激素（三）植物激素1、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要、不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要求求存在较大的差异存在较大的差异。2、生长素中常用的是、生长素中常用的是2,4-D、NAA，在细胞分裂素，在细胞分裂素中最常用的是中最常用的是BAP、KT、2-IP。3、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、在不同的生长发育阶段（起始分裂、细胞团形成、愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗），愈伤组织形成与器官分化、胚状体发生与成苗），需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调需要不断对培养基中激素的种类和浓度进行适时调整。整。（1）在原生质体培养中，加入）在原生质体培

18、养中，加入2,4-D对于原生对于原生质体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈质体再生细胞壁，启动分裂，持续分裂直至形成愈伤组织是很有效的，如禾谷类植物。伤组织是很有效的，如禾谷类植物。（2）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结）一般细胞分裂素和生长素以一定配比结合使用。合使用。（3）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体）由活跃生长的培养细胞分离的原生质体要求较高的生长素要求较高的生长素/分裂素配比才能进行分裂；分裂素配比才能进行分裂；由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体，由高度分化的细胞如叶肉细胞得到的原生质体，常需要较高的分裂素常需要较高的分裂素/生长素配比才能进行脱分化。生长素配比才能

19、进行脱分化。（四）氮源（四）氮源许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质许多研究指出，适当浓度的谷氨酰胺对原生质体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。体的细胞壁再生、细胞分裂和生长都有明显的作用。NH4+浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养浓度太高的培养基不宜用作原生质体培养基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体基。铵对许多植物（如烟草、马铃薯）的原生质体有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中有毒害作用，抑制原生质体的生长。降低培养基中NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续分裂都有利。都有利。还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产

20、生毒还有很多实验发现硝酸盐对原生质体可产生毒害作用，因此使用时应特别注意其用量。害作用，因此使用时应特别注意其用量。（五）复杂有机物（五）复杂有机物在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物，在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物，可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞团的形成。团的形成。常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。二、二、培养方法培养方法v原生质体培养一般采用液体培养的方法，原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为因为：（一）（

21、一）液体浅层培养液体浅层培养（二）（二）平板法培养平板法培养（三）（三）悬滴法培养悬滴法培养（四）（四）固液结合培养法固液结合培养法原生质体培养一般采用液体培养原生质体培养一般采用液体培养1、有些物种的原生质体不能在固体培养基上、有些物种的原生质体不能在固体培养基上分裂。分裂。2、采用液体培养有利于调整培养基成分。、采用液体培养有利于调整培养基成分。3、采用液体培养可将经过几天高密度培养之、采用液体培养可将经过几天高密度培养之后的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。后的细胞密度降低，也可将感兴趣的细胞分离出来。（一）液体浅层培养（一）液体浅层培养1、方法、方法把原生质体以一定的密度（把原

22、生质体以一定的密度（约约2105个个/mL）悬浮在液体）悬浮在液体浅层培养基中（浅层的厚度以浅层培养基中（浅层的厚度以1mm为宜），用石蜡膜封住平为宜），用石蜡膜封住平皿后，放在适宜条件下培养。皿后，放在适宜条件下培养。2、优劣、优劣优点是优点是：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基：操作方便，对原生质体的伤害也小；培养基与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止与空气接触面大、通气好；原生质体的代谢物易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新了有害物质积累过多而造成毒害；便于转移培养物或添加新鲜培养基。鲜培养基。缺点是缺点是：原生质体分布不均，易造成局部密度

23、过高或：原生质体分布不均，易造成局部密度过高或原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育；原生质体粘聚而影响其再生细胞的分裂和进一步的生长发育；难以实施定点观察和跟踪观察。难以实施定点观察和跟踪观察。（二）平板法培养（二）平板法培养 1、方法、方法取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至取适量原生质体悬浮液，与热融并冷却至45的含琼脂的含琼脂或琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均或琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器匀分布。待凝固后，将培养容器置于四周垫有保湿材料的容器内。内。2、优劣、优劣有利于原生质

24、体均匀分布；有利于原生质体均匀分布；便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、便于定点观察，可跟踪观察单个原生质体的细胞壁再生、分裂等行为；分裂等行为；也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。（三）悬滴法培养（三）悬滴法培养 1、方法、方法将适宜密度的原生质体悬浮液，用滴管或定量加液器，将适宜密度的原生质体悬浮液，用滴管或定量加液器，以以50ul/100ul的小滴接种于培养皿盖内，其数量以滴与滴间不的小滴接种于培养皿盖内，其数量以滴与滴间不相碰为原则，皿底加入液体以保湿。将皿盖稳妥地盖在皿底相碰为原则，皿底加入液体以保湿。将皿盖稳妥地盖在皿底

25、上，封口培养。上，封口培养。2、优劣、优劣优点是优点是：所用材料较少，培养液用量也少；有利于通：所用材料较少，培养液用量也少；有利于通气和观察，气和观察，易添加培养基；不易污染等。适合低密度培养。易添加培养基；不易污染等。适合低密度培养。缺点是缺点是：原生质体分布不均，易集中于小滴中央；液：原生质体分布不均，易集中于小滴中央；液滴与空气接触面大，培养基成分和物理特性易于变动。滴与空气接触面大，培养基成分和物理特性易于变动。（四）固液结合培养法（四）固液结合培养法1、双层培养法、双层培养法在培养皿底先铺一层固体培养基（含或不含原生质体在培养皿底先铺一层固体培养基（含或不含原生质体/细胞），再在其

26、上进行原生质体的液体浅层培养。细胞），再在其上进行原生质体的液体浅层培养。2、切块悬浮培养、切块悬浮培养先将原生质体包埋于固体平板，再将其切成小块，投先将原生质体包埋于固体平板，再将其切成小块，投入到大体积的液体培养基中，并放于摇床上进行振荡培养。入到大体积的液体培养基中，并放于摇床上进行振荡培养。3、琼脂糖珠培养法、琼脂糖珠培养法即将原生质体与琼脂糖培养基混合后，逐滴滴在培养即将原生质体与琼脂糖培养基混合后，逐滴滴在培养皿底面，待其凝固后，再在其周围加入液体培养基。采用这皿底面，待其凝固后，再在其周围加入液体培养基。采用这种方法可以在液体培养基中加入经辐射处理的细胞。种方法可以在液体培养基中

27、加入经辐射处理的细胞。三、培养密度三、培养密度1、原生质体适宜的培养密度一般为、原生质体适宜的培养密度一般为1104-1105个个/ml，但这不利于单细胞无性系的筛选。，但这不利于单细胞无性系的筛选。2、低密度下培养原生质体，可通过改良培养、低密度下培养原生质体，可通过改良培养基组成和改进培养方法入手。基组成和改进培养方法入手。（1）一般培养基成分越复杂越全面，原生质）一般培养基成分越复杂越全面，原生质体的培养的植板密度就可以越低。体的培养的植板密度就可以越低。（2）改进培养方法也可有效降低培养密度。）改进培养方法也可有效降低培养密度。如饲喂细胞层法；不同类型的原生质体混合培养的如饲喂细胞层法

28、；不同类型的原生质体混合培养的方法等。方法等。四、培养条件四、培养条件（一）光照（一）光照1、新分离出的原生质体应在散射光或黑暗中培养。、新分离出的原生质体应在散射光或黑暗中培养。2、在原生质体对光敏感的情况下，应尽量减少观察的、在原生质体对光敏感的情况下，应尽量减少观察的次数，凡经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。次数，凡经观察过的原生质体不应包括在以后的实验结果中。（二）温度（二）温度1、原生质体培养一般在、原生质体培养一般在25-30 下进行。下进行。2、较高的培养温度往往有利于启动和维持原生质体的、较高的培养温度往往有利于启动和维持原生质体的分裂。分裂。（三）湿度（三）湿度在

29、原生质体固体培养和小液滴培养中，应注意培养湿在原生质体固体培养和小液滴培养中，应注意培养湿度的保持。度的保持。第四节第四节 由原生质体再生植株由原生质体再生植株一、原生质体再生细胞壁，一、原生质体再生细胞壁，形成完整细胞形成完整细胞。二、二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织细胞分裂形成细胞团或愈伤组织。三、由愈伤组织分化形成三、由愈伤组织分化形成植株植株。一、原生质体再生细胞壁一、原生质体再生细胞壁原生质体在培养中能否再生细胞壁并进行持续原生质体在培养中能否再生细胞壁并进行持续的分裂是关系到原生质体培养成败的关键因素。的分裂是关系到原生质体培养成败的关键因素。1、一般，原生质体再生细胞壁是其进行正

30、常、一般，原生质体再生细胞壁是其进行正常分裂的前提。分裂的前提。2、新形成的细胞壁是由排列松散的微纤丝组、新形成的细胞壁是由排列松散的微纤丝组成的，由这些微纤丝组成典型的细胞壁。成的，由这些微纤丝组成典型的细胞壁。3、细胞壁的形成既受原生质体内在因子（如、细胞壁的形成既受原生质体内在因子（如基因型、原生质体来源）的控制，也受培养基组成基因型、原生质体来源）的控制，也受培养基组成等外界因素的影响。等外界因素的影响。二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织二、细胞分裂形成细胞团或愈伤组织原生质体再生壁后开始第一次分裂的时间，随原生质体再生壁后开始第一次分裂的时间，随植物种类、分离原生质体的材料、原生质体的

31、质量、植物种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基和培养条件而异。培养基和培养条件而异。并非所有再生细胞壁的原生质体都能进行分裂，并非所有再生细胞壁的原生质体都能进行分裂，一般凡能分裂的原生质体，在经过第一次分裂并持一般凡能分裂的原生质体，在经过第一次分裂并持续分裂后，将形成肉眼续分裂后，将形成肉眼可见的愈伤组织可见的愈伤组织。第四节第四节 体细胞杂交体细胞杂交一、体细胞杂交及一、体细胞杂交及一般步骤一般步骤二、原生质体融合的二、原生质体融合的一般过程一般过程三、原生质体三、原生质体融合方法融合方法（一）自发融合（一）自发融合（二）诱发融合（二）诱发融合四、原生质体融合产物的四、原生质

32、体融合产物的细胞学细胞学五、杂种细胞五、杂种细胞选择选择六、杂种植株六、杂种植株鉴定鉴定七、细胞质七、细胞质杂种杂种一、体细胞杂交及一般步骤一、体细胞杂交及一般步骤1、体细胞杂交、体细胞杂交指完全不经过有性过程，通过体细胞融合得到杂种指完全不经过有性过程，通过体细胞融合得到杂种细胞，再对杂种细胞培养使其分化形成杂种植株的过细胞，再对杂种细胞培养使其分化形成杂种植株的过程。程。2、步骤、步骤原生质体制备原生质体制备原生质体融合原生质体融合杂种细胞选择杂种细胞选择杂杂种细胞培养种细胞培养杂种植株再生杂种植株再生杂种植株鉴定杂种植株鉴定二、原生质体融合的一般过程二、原生质体融合的一般过程（一）包含了

33、三个连续的（一）包含了三个连续的主要阶段主要阶段：1、凝聚作用；、凝聚作用；2、细胞质桥的出现；、细胞质桥的出现；3、细胞质桥的扩展和细胞的融合。、细胞质桥的扩展和细胞的融合。（二）（二）注意注意利用不同品系的甜菜叶肉细胞进行电融合利用不同品系的甜菜叶肉细胞进行电融合图中下方的黑带是电极。图中下方的黑带是电极。v 原生质体的粘连并不一定必然导致膜的融合。原生质体的粘连并不一定必然导致膜的融合。如伴刀蛋白如伴刀蛋白A或抗体都能促使原生质体的凝聚，或抗体都能促使原生质体的凝聚，但之后很少发生或不发生原生质体的融合。但之后很少发生或不发生原生质体的融合。v 植物原生质体表面所带的电荷会阻止原生质体的

34、植物原生质体表面所带的电荷会阻止原生质体的粘连。粘连。三、原生质体融合方法三、原生质体融合方法（一）自发融合（一）自发融合 相邻的同种原生质体借助相邻的同种原生质体借助胞间连丝胞间连丝可发生融合，形成多可发生融合，形成多核的原生质体，这种不经外界因素诱导就发生的原生质体融核的原生质体，这种不经外界因素诱导就发生的原生质体融合称为自发融合。合称为自发融合。避免这种自发融合：切断胞间连丝。避免这种自发融合：切断胞间连丝。（二）诱发融合（二）诱发融合 在外加因素诱导下的原生质体融合为诱发融合在外加因素诱导下的原生质体融合为诱发融合1、化学融合法化学融合法2、电融合法、电融合法1、化学融合法、化学融合

35、法vNaNO3处理：中和质膜表面负电荷，使之紧密结处理：中和质膜表面负电荷，使之紧密结合；合；诱导形成异核体的频率低，特别时原生质体来自于高诱导形成异核体的频率低，特别时原生质体来自于高度液泡化的叶肉细胞时。度液泡化的叶肉细胞时。v高高pH-高浓度高浓度Ca2+处理处理v聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）处理）处理聚乙二醇：为一种聚合化合物分子量在聚乙二醇：为一种聚合化合物分子量在1500-6000之间，之间，易溶于水。易溶于水。诱导特点诱导特点（1）形成的异核体频率较高，特别是双核异核体的比例）形成的异核体频率较高，特别是双核异核体的比例较高。较高。（2）PEG诱导原生质体融合没有特异性；诱导原生

36、质体融合没有特异性；（3）实验可重复性很高。）实验可重复性很高。（4）PEG对大多数细胞类型毒性低，适合于大多数物种对大多数细胞类型毒性低，适合于大多数物种的原生质体融合。的原生质体融合。诱导方法诱导方法1）收集原生质体；）收集原生质体；2）将两种不同来源的原生质体以适当比例混合（如）将两种不同来源的原生质体以适当比例混合（如1：1），），静置使之沉降，增加触融机会。静置使之沉降，增加触融机会。3）用）用28%-58%的的PEG溶液处理溶液处理15-30分钟，促使原生质体相分钟，促使原生质体相互粘连；互粘连；4）然后用清洗培养基逐步清洗原生质体上的）然后用清洗培养基逐步清洗原生质体上的PEG，

37、或用高，或用高PH高浓度钙离子溶液清洗。高浓度钙离子溶液清洗。注意清洗应逐步平缓进行，剧烈洗涤会减少异核体的形成。注意清洗应逐步平缓进行，剧烈洗涤会减少异核体的形成。5）融合体的培养。）融合体的培养。诱导机制诱导机制四、原生质体融合产物的四、原生质体融合产物的细胞学细胞学v间期核融合的结果并不产生有活力的杂种细胞，只有有丝间期核融合的结果并不产生有活力的杂种细胞，只有有丝分裂期间的核融合形成的杂种细胞才能继续进一步的发育。分裂期间的核融合形成的杂种细胞才能继续进一步的发育。v原生质体融合将产生以下杂种细胞：原生质体融合将产生以下杂种细胞：1、亲合的细胞杂种：、亲合的细胞杂种：具有双亲的全套染色

38、体，并能进行正常分裂，形成异源双具有双亲的全套染色体，并能进行正常分裂，形成异源双倍体。倍体。2、部分亲合的细胞杂种：、部分亲合的细胞杂种：一个亲本的染色体组或全部消失，或其染色体只有部分一个亲本的染色体组或全部消失，或其染色体只有部分的保留或重组于另一亲本的染色体组。的保留或重组于另一亲本的染色体组。3、形成非整倍体的混合群体：、形成非整倍体的混合群体：如粉蓝烟草（如粉蓝烟草（2N=24）和南氏烟草（）和南氏烟草（2N=18）获得的体细）获得的体细胞杂种，其染色体数处于胞杂种，其染色体数处于56-64之间。之间。4、胞质杂种、胞质杂种：包含一个亲本的染色体组，但包含双亲的细包含一个亲本的染色

39、体组，但包含双亲的细胞质。胞质。普通小麦和簇毛麦体细胞杂交获得的杂种细胞染色体普通小麦和簇毛麦体细胞杂交获得的杂种细胞染色体(红色荧光者为普通小麦染色体，黄色者为簇毛麦染色体红色荧光者为普通小麦染色体，黄色者为簇毛麦染色体)五、杂种细胞选择五、杂种细胞选择v选择的必要性选择的必要性v杂种细胞选择方法杂种细胞选择方法1、对于在、对于在形态上形态上易区分的原生质体及杂种细胞，可易区分的原生质体及杂种细胞，可在低密度下培养，然后用机械方法将杂种细胞分离在低密度下培养，然后用机械方法将杂种细胞分离出来。出来。2、荧光染料标记、荧光染料标记选择选择3、互补、互补选择法选择法 利用两亲本原生质体对培养基成

40、分、抗代谢物或温度等利用两亲本原生质体对培养基成分、抗代谢物或温度等的敏感性存在着的天然的互补性差异，以及隐性突变造成的的敏感性存在着的天然的互补性差异，以及隐性突变造成的遗传互补来筛选杂种细胞。遗传互补来筛选杂种细胞。互补选择法互补选择法v利用不同亲本原生质体在遗传上、抗性上和生理上的利用不同亲本原生质体在遗传上、抗性上和生理上的互补进行选择：互补进行选择：白化（白化（aaBB）+白化（白化（AAbb）绿色（绿色（AaBb）营养缺陷（营养缺陷（aaBB）+营养缺陷（营养缺陷（AAbb）自养（自养（AaBb）抗性（抗性（aaBB）+抗性（抗性（AAbb）双抗（双抗（AaBb）v对培养基成分和抗

41、代谢物对培养基成分和抗代谢物互补互补v对光照敏感性互补对光照敏感性互补叶绿体缺失突变体叶绿体缺失突变体光敏突变体光敏突变体融合，高光强下培养只有杂种细胞只有杂种细胞形成绿色的对形成绿色的对光不敏感的细光不敏感的细胞团胞团矮牵牛两个种的原生质体对培养基成分及矮牵牛两个种的原生质体对培养基成分及放线菌素放线菌素D（抗代谢物）的敏感性存在差异（抗代谢物）的敏感性存在差异原生质体类型原生质体类型在在MS培养基上能培养基上能否形成愈伤组织否形成愈伤组织对放线菌素对放线菌素D敏感性敏感性甲种甲种不能不能不敏感不敏感乙种乙种能能敏感敏感杂种细胞杂种细胞能能不敏感不敏感六、杂种植株鉴定六、杂种植株鉴定（一）鉴

42、定的目的（一）鉴定的目的 确认体细胞杂种的杂种性；杂种所拥有的的遗传组成及性状变异情况。确认体细胞杂种的杂种性；杂种所拥有的的遗传组成及性状变异情况。（二）鉴定方法（二）鉴定方法1、形态鉴定、形态鉴定（1）在种间体细胞杂种中，杂种表现或多或少居于融合亲本之）在种间体细胞杂种中，杂种表现或多或少居于融合亲本之间，而在属间的体细胞杂种中，表现型更多的是偏向于亲本之间，而在属间的体细胞杂种中，表现型更多的是偏向于亲本之一。一。（2）在鉴定中注意环境条件及非整倍变异的影响。）在鉴定中注意环境条件及非整倍变异的影响。2、细胞学分析、细胞学分析3、酶谱分析：、酶谱分析：如同工酶、淀粉酶、天冬氨酸氨基转移酶

43、等如同工酶、淀粉酶、天冬氨酸氨基转移酶等4、DNA内切图谱分析内切图谱分析七、细胞质杂种七、细胞质杂种v细胞质杂种：由两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）细胞质杂种：由两种来源不同的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组（双亲之一）结合形成的细胞杂种。与一个特定的核基因组（双亲之一）结合形成的细胞杂种。（一）细胞质杂种的获得途径（一）细胞质杂种的获得途径1、通过原生质体融合和培养、通过原生质体融合和培养获得获得2、诱导原生质体摄入细胞器获得胞质杂种、诱导原生质体摄入细胞器获得胞质杂种（二）胞质杂种的应用（二）胞质杂种的应用 在种内或种间转移细胞质遗传物质控制的性状。如雄性不育。在种内或种间

44、转移细胞质遗传物质控制的性状。如雄性不育。（三）细胞质杂种的鉴定（三）细胞质杂种的鉴定1、表型鉴定、表型鉴定2、生化鉴定和核酸（核外）酶切分析、生化鉴定和核酸（核外）酶切分析 如对如对1，5二磷酸核酮糖羧化酶（二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPcase)亚基多肽图谱亚基多肽图谱的分析（该酶小亚基多肽有核的分析（该酶小亚基多肽有核DNA编码，大亚基有叶绿体编码，大亚基有叶绿体DNA编码）编码）在原生质体能够完全融合情况下，胞质杂种可通过以下途径在原生质体能够完全融合情况下，胞质杂种可通过以下途径产生：产生：（1）一个正常的原生质体与一个去核的原生质体融合；）一个正常的原生质体与一个去核的原生质体融合；

45、（2）一个正常的原生质体和一个核失活的原生质体融合；）一个正常的原生质体和一个核失活的原生质体融合；（3）在异核体形成之后二个核中有一个消失；）在异核体形成之后二个核中有一个消失；（4）在较晚的时期发生染色体选择性的消除。）在较晚的时期发生染色体选择性的消除。第六节第六节 原生质体的应用价值原生质体的应用价值一、在植物遗传改良上的应用一、在植物遗传改良上的应用1、扩大物种间遗传物质交流的范围，创造新种。、扩大物种间遗传物质交流的范围，创造新种。2、转移优良性状，改良、转移优良性状，改良现有品种现有品种3、作为遗传转化的受体应用于基因工程。、作为遗传转化的受体应用于基因工程。4、利用原生质体无性系变异选育新种质。、利用原生质体无性系变异选育新种质。二、基础理论研究上的应用二、基础理论研究上的应用1、在植物生理学研究中的应用：如细胞壁再生、内吞作用、在植物生理学研究中的应用：如细胞壁再生、内吞作用、气孔生理、离子吸收与运输等；气孔生理、离子吸收与运输等；2、在基因表达表达调控研究中的应用；、在基因表达表达调控研究中的应用；3、在植物病毒分子生物学研究中的应用。、在植物病毒分子生物学研究中的应用。由由普普通通小小麦麦和和高高冰冰草草经经体体细细胞胞杂杂交交获获得得的的第第三三代代植植株株