第七章-病毒基因工程-病毒学课件.ppt

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1、1第七章 病毒基因工程 2p第一节 病毒基因工程的主要研究内容p第二节 病毒载体的主要类型及其应用 3第一节 病毒基因工程的主要研究内容 n 病毒基因工程主要研究目的就是利用重组DNA技术，高效表达病毒基因及其他外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、抗病毒制剂以及进行基因治疗。4一、病毒基因及基因组结构与功能研究病毒基因工程技术和方法运用于病毒学研究，对于阐明病毒基因及基因组结构与功能的关系和一些病毒的基因表达调控机理有重要作用。pRNA肿瘤病毒反转录酶的发现，使中心法则得以完善及发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规手段。p认识到有关真核基因表达调控的内在

2、规律及原理，如基因重叠现象、转录后加工、启动子及增强子等。6n最初的乙肝疫苗是血源性疫苗(plasma-derived vaccine，PDV)从乙型肝炎急性期病人的血清中分离的澳抗(HBsAg)制备而成的血源有限、价格昂贵，还存在潜在的不安全性，因为乙型肝炎病毒携带者还可能感染HIV等其他病毒。n第一个基因工程酵母重组乙型肝炎疫苗由默克公司于1986年开发成功，它是用酵母表达澳抗制备的基因工程亚单位疫苗。7三、抗病毒药物与制剂的研制n 抗病毒感染的药物如干扰素、转移因子、活性多肽等，它们有的来源于病毒，有的来源于病毒感染细胞时宿主的反应产物在组织细胞内产量极微，所以采用常规方法很难满足临床需

3、要。p1983年，Smith等首次利用AcMNPV做载体成功表达人的-干扰素，与天然干扰素相同的生物学活性。p1994年我国批准基因工程干扰素1b的临床使用。p采用基因工程技术还可以把几个不同型别的干扰素基因拼接起来，生产具有多种特性和功能的自然界所没有的活性多肽物质，例如把D与A基因拼接后产生的干扰素，既具有具D的某些性状，又具有A的一些性状。8四、病毒载体的构建与应用n 病毒载体就是利用病毒的基因组序列元件构建外源基因转移或表达的工具，多用于真核基因表达，具有以下独特的优点。病毒基因组结构简单，易于改造和操作。病毒增殖速度快，外源基因可高效表达。病毒能感染特定受体细胞，使外源基因的导入效率

4、高。病毒具有特异的宿主范围、组织嗜性和靶向性，对基因治疗有益。病毒的种类繁多，且各具不同的特性，构建的病毒载体也相应地具备不同的特点。10五、病毒性疫病的基因诊断方法的建立n传统培养病毒方法与免疫学诊断方法在时间、敏感性与特异性方面存在一定的局限性，并且一些病毒在实验室内现在很难或尚无较好的培养方法，难以制备抗血清进行血清学鉴定。n基因诊断技术在一定程度上弥补了传统方法的不足，而且具有微量、快速、特异等优点。目前应用最广泛的基因诊断方法有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、核酸分子杂交、基因芯片、生物传感器等。11第二节 病毒载体的主要类型及其应用n根

5、据外源基因与病毒基因组的整合方式，可将病毒载体分为，置换型载体和插入型载体。n根据载体进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为质粒载体与病毒载体。n根据宿主类型可将病毒载体分为噬菌体载体、杆状病毒载体、动物病毒载体、植物病毒载体等。13(一)噬菌体n左臂从A到J，长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝等蛋白质。n中段长约20kb，是噬茵体DNA整合和切出、溶原性生长所需的序列。n右臂长8-10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长的基因调控序列以及噬菌体DNA的复制起始区。15(二)M13丝状噬菌体nM13是温和性噬菌体，装配成熟后分泌到细胞外，不产生溶菌作用。被感染的细胞一个世代可释放出约

6、1000个子代噬菌体颗粒。n虽然M13噬菌体只含环状单链DNA，但是在复制过程中仍以双链DNA为中间媒介，可以如同质粒DNA一样进行操作。+链DNA 16M13丝状噬菌体载体 nM13的感染与释放不会杀死宿主菌，仅使宿主细胞生长缓慢。nM13 DNA在宿主细胞中既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13 DNA导入宿主细胞中。nM13的包装不受DNA大小的限制，噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。n可用于制备大量纯化的单链DNA分子。M13噬菌体载体的主要用途是为Sanger ddNTP链终止法测定DNA序列制备单链D

7、NA模板。18杆状病毒载体的优点 由于杆状病毒的核衣壳可大幅度延伸，对外源基因克隆容量大。杆状病毒的多角体蛋白基因的启动子是最强的真核基因启动子之一，外源基因能高水平表达。构建多元杆状病毒载体或用几个不同的重组杆状病毒载体共感染细胞，可同时表达2个或更多的外源基因。利用在昆虫细胞中表达的外源蛋白的生物活性接近天然蛋白质。杆状病毒对于脊椎动物无病原性，被认为是遗传学上安全的表达载体。利用重组杆状病毒感染昆虫或相应的昆虫细胞，可以工业化生产BEVS表达的重组蛋白。19昆虫杆状病毒系统的应用 n自1983年Smith等首次利用AcMNPV表达成功人2干扰素以来，有近千种外源基因在该系统中得到表达，其

8、中大部分表达产物是具较大潜力的高价值的药用物质。nAcMNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物的细胞，如肝细胞AcMNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗的媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类的基因治疗中得到应用。n利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂。20三、动物病毒载体n 当表达高等真核基因时，应用哺乳动物表达体系比应用原核及昆虫表达体系显得更为优越，这是因为原核及昆虫细胞表达体系不能对外源真核基因产物在转录及转译后进行有效的修饰。目前较广泛地应用于哺乳动物细胞表达体系的载体有猴病毒40(simian virus40，SV40)，痘病毒(Poxvirus)，腺病毒（Adenovirus）

9、、逆转录病毒(Retroviruses)载体等。21SV40载体 nSV40是一种能感染猿、猴等哺乳动物的DNA病毒，其基因组为环状双链DNA。n基因组在功能上分为早期转录和晚期转录两个区域。早期转录形成两种成熟的mRNA，分别编码小t抗原和大T抗原。小t抗原在病毒感染中的作用不明，大T抗原对DNA的复制起始起着十分重要的作用。n晚期转录的VP1、VP2和VP3是病毒的衣壳蛋白。22SV40载体的构建nSV40 DNA中的非必需区很小，插入外源基因时，需除去某些区段：早期基因被置换时，不能合成T抗原；晚期基因被置换时，则不能合成衣壳蛋白均形成所谓的缺损性病毒。n载体构建时一般在晚期转录单位中插

10、入外源DNA，由于晚期启动子的转录水平高于早期启动子，因此外源 DNA转录的RNA和表达的蛋白量也较高。但需另一个SV40的温度敏感变异株(tsA株)作为辅助病毒提供衣壳蛋白，形成子代病毒颗粒。n早期基因被置换时，形成的重组 DNA没有T抗原，需要cos细胞来解决。cos细胞是己被 SV40 DNA转化了的猴传代细胞，在其染色体内的SV40 DNA编码功能T抗原，但因缺乏复制起始点，病毒DNA不能复制。将重组 DNA导入cos细胞，可以形成含有重组DNA的病毒颗粒。24痘苗病毒载体n痘苗病毒（Vaccinia Virus）是人们熟悉的一种病毒，它被人们用作疫苗根除天花病。n利用痘苗病毒作为基因

11、表达载体的优点为：p基因组很大，故可用于插入的外源基因量也较大，病毒宿主范围广；p病毒在胞质中复制与增殖，无致癌性。p重组痘病毒可在人体接种作为活疫苗。pVV可容纳长达2540kb的外源基因插入，甚至可在同一非必需区或不同非必需区插入多个外源基因。25四、植物病毒载体n在植物病毒载体中研究得较为深入的是植物病毒中唯一的双链DNA病毒-花椰菜花叶病毒(Califlower mosic virus，CaMV)。CaMV是感染十字花科作物的病毒，基因组为约8 kb的环状dsDNA分子。有多种限制性核酸内切酶的切点。n植物病毒载体具有很多优点，例如短时间内可以生产大量成本低廉的外源蛋白，满足医药及工业

12、用蛋白的需求。n近年来也逐步利用植物病毒载体作为探针，用于研究植物和植物病原基因的表达调控、编码产物的功能以及植物与病原的相互作用。26花椰菜花叶病毒载体 n互补载体系统：由缺陷型CaMV DNA与辅助病毒组成互补系统。外源基因克隆到CaMV基因组中，在共感染植物细胞时，外源基因能在CaMV 35S启动子驱动下表达，由于辅助病毒的协助，可组成重组病毒颗粒。n混合载体系统：将CaMV DNA插入Ti质粒的T-DNA中，转化根瘤农杆菌，由细菌介导的将CaMV基因组转移至植物细胞基因组内，并产生对植物细胞的感染称土壤杆菌感染作用（Agroinfection）。n融合载体系统：利用CaMV强启动子35S构建成融合载体，插入外源基因，在35S启动子驱动下在植物细胞中表达外源基因。