FACSCanto流式细胞仪原理.pptx

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1、BD公司介绍公司介绍BD公司是由Maxwell W.Becton和Fairleigh S.Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州第1页/共79页BDBD公司介绍公司介绍位居财富周刊500强的大型跨国公司产品涵盖诸多医疗领域生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试剂、耗材第2页/共79页BDBD公司流式细胞仪产品公司流式细胞仪产品FACS Vantage SE-大型分选机nFACS Aria-高速分选的台式机nFACS Diva-高速分选的数字化大型机第3页/共79页BDBD公司流式细胞仪产品公司流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSCalibur流式细

2、胞仪FACSCanto II流式细胞仪第4页/共79页BD BD 公司流式细胞仪产品公司流式细胞仪产品BD FACSCanto II流式细胞仪第5页/共79页FACSCanto II流式流式细胞仪原理细胞仪原理第6页/共79页流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标?细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC）细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向散射光信号，SSC）相关的荧光强度第7页/共79页散射光信号的特征散射光信号的特征FSC和SSC当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角

3、散色光信号（SSC）。488nm激光激发产生散射光第8页/共79页前向角散射光信号前向角散射光信号FSC第9页/共79页侧向角散射光信号侧向角散射光信号SSC第10页/共79页散射光信号的特征散射光信号的特征红细胞裂解的全血第11页/共79页荧光信号的特征荧光信号的特征什么是荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。第12页/共79页荧光信号的特征荧光信号的特征发射光的荧光强度与结合的位点成正比第13页/共79页信号产生信号产生荧光信号第14页/共79页荧光信号的特征荧光信号的特征常见

4、荧光染料的发射波长第15页/共79页直方图显示荧光信号直方图显示荧光信号第16页/共79页点图显示荧光信号点图显示荧光信号第17页/共79页流式细胞仪特点及检测标本流式细胞仪特点及检测标本特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液第19页/共79页FACSCanto II流式细胞仪系统组成流式细胞仪系统组成流式细胞仪液流车工作站第20页/共79页FACSCantoFACSCanto简介简介配置空冷激光两根激光:488nm、633nm、光路固定，无需调校液流系统信号检测系统八角

5、形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号电子系统将电信号转换成数字化信号第21页/共79页液流系统液流系统流动室鞘液工作液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。样本流单细胞悬液，浓度51051 106/mL第22页/共79页液流系统液流系统鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激光激发后，样本中的颗粒被检测。第23页/共79页液流系统液流系统 -FLOW CELL(FLOW CELL(流动室流动室)Injector Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘

6、液鞘液第24页/共79页液流系统液流系统第25页/共79页液流系统液流系统-样本流速样本流速第26页/共79页样本流速的选择样本流速的选择高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。第27页/共79页光学系统光学系统第28页/共79页光学系统光学系统染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号被收集、过滤然后被检测器转换成电信号。第29页/共79页信号采集系统信号采集系统激光488nm，633nm，激发样本中

7、的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号信号检测组件-八角形和三角形光学滤片将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMTPMT-将光信号转换成电信号第30页/共79页常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色 PerCP 488 670 免疫荧光 深红APC 633 670 免疫荧光 红色PI 488 620 DNA染色 橙红ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红第31页/共79页 常用荧光染料常用荧光染料(488nm

8、,633nm(488nm,633nm激激发发)Fluorescein Isothiocyanate(FITC)异硫氰酸荧光素Phycoerythrin(PE)藻红素Allophycocyanin(APC)异藻蓝蛋白Peridinin-Chlorophyll Protein(PerCP)多甲藻黄素-叶绿素蛋白Tandem DyesPE-Texas Red(ECD)PE-Cy5(PC5)PE-Cy5.5(PC5.5)(futures)PE-Cy7(PC7)(futures)第32页/共79页FACSCanto信号检测组件信号检测组件种类八角形三角形构成检测器滤片第33页/共79页FACSCanto

9、FACSCanto信号检测组件信号检测组件八角形检测组件第34页/共79页FACSCanto信号检测组件信号检测组件三角形检测组件第35页/共79页FACSCanto信号检测组件信号检测组件检测器鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。FACSCanto 两类检测器光电二极管：FSC光电倍增管PMT：SSC和荧光信号第36页/共79页FACSCanto信号检测组件信号检测组件光学滤片用于调整光谱的分布。当光子遇到滤片时，光子或通过滤片，或被滤片吸收，或被滤片反射。第37页/共79页FACSCanto的滤片的滤片长通滤片（LP）：长

10、于设定波长的光通过，并反射短于设定波长的光第38页/共79页FACSCanto的滤片的滤片带通滤片：允许一定带宽波长的光通过。第39页/共79页FACSCanto的滤片的滤片第40页/共79页FACSCantoFACSCanto的滤片的滤片第41页/共79页FACSCanto电子系统电子系统将与电脉冲信号 强弱相关的电压 数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积信号A宽度信号W第42页/共79页几个概念几个概念信号放大PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。阈值信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一

11、设定值称为阈值。第43页/共79页几个概念几个概念颜色补偿采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。第44页/共79页颜色补偿颜色补偿FITC主要由FITC的检测器检测，但部分光也会进入PE检测器第45页/共79页几个概念几个概念颜色补偿带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。第46页/共79页几个概念几个概念颜色补偿通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%第47页/共79页补偿模型图第48页/共79页颜色补偿判断标准颜色补偿判断标准 未作颜色补偿第49页/共79页颜色补偿判断标准颜

12、色补偿判断标准 补偿后第50页/共79页怎样进行颜色补偿怎样进行颜色补偿Comp Beads用于流式细胞仪多色分析时调整荧光补偿。含两种微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白链的微球，可与小鼠/大鼠免疫球蛋白的链结合；及阴性对照微球，不与免疫球蛋白结合。这两种微球与鼠源性的荧光抗体混合时，显示为清晰的阳性群与阴性群（背景荧光），可据此手动调整颜色补偿。Anti-Mouse Ig补偿微球组合，产品号：552843Anti-Rat Ig补偿微球组合，产品号：552844Anti-Rat/hamsterIg补偿微球组合，产品号：552845第51页/共79页仪器运作需要的质控品仪器运作需要的质控品仪器校准需要

13、微球BD FACS 7-Color Setup Beads（）补偿调整需要微球BD CompBeads Anti-Mouse Ig,(Cat No.552843)BD CompBeads Anti-Rat Ig,(Cat No.552844)仪器清洁BD FACSRinse漂白水第52页/共79页流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用第53页/共79页流式细胞仪可以告诉我们什么？流式细胞仪可以告诉我们什么？第54页/共79页细胞内和细胞外发生了什么事件？细胞内和细胞外发生了什么事件？第55页/共79页流式细胞术的应用流式细胞术的应用细胞生理学研究细胞膜表面标记胞内标记细胞周期分析凋亡分析分选CBA第

14、56页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞相对大小和颗粒性胞内pH值检测Ca+流动性检测膜电势检测细胞活性检测细胞活力(增殖能力)的检测第57页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞相对大小和颗粒性分析第58页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究胞内pH值的检测第59页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究Ca2+流动性检测Ca2+是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。最常用的染料Indo-1 excited at UVFluo-3 excited at 488nmFura red excited at 488nm

15、第60页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究Ca2+流动性检测第61页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞膜电位的改变超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin Gramicidin D CCCP第62页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞膜电位的改变第63页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光第64页/共79

16、页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞活力分析CFSE(Carboxyfluorescein Succinimidyl ester)是一种亲脂性染料，可被细胞膜吸收。细胞标记CFSE后再诱导增殖，分裂后的细胞将含半量的CFSE，如此可监控细胞分裂的数目。第65页/共79页细胞生理学研究细胞生理学研究细胞活力分析上图中人T细胞被标记并刺激后，可跟踪六代的分裂。如果配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。第66页/共79页细胞膜表面标记细胞膜表面标记CD2CD2CD4CD4CD#=clusterdesignationnumber第67页/共79页细胞内标记细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记

17、，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase.胞内细胞因子磷酸化蛋白 第68页/共79页细胞内标记细胞内标记胞内细胞因子第69页/共79页细胞内标记细胞内标记磷酸化蛋白接受刺激后细胞的动态反应刺激因子对特异位点的作用检测转录后调控特殊蛋白在正常及异常细胞的表达第70页/共79页细胞内标记细胞内标记磷酸化蛋白RelativeCellNumberAlexaFluor488ControlIFN-g gstimulated(1000u/ml)第71页/共79页细胞周期分析细胞周期分析DNA含量分析-PI染色第72页/共79页细胞周期分析细胞周期分析DNA含量分析第73页/共79页细胞凋亡细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合第74页/共79页CBA（Cytometric Bead Array）+Analyte of InterestFluorescent Detector AbCapture BeadCapture Ab第75页/共79页CBA第76页/共79页BD网站网站更多的产品信息请登陆 第77页/共79页谢谢大家谢谢大家第78页/共79页感谢您的观看！第79页/共79页