基因工程第二章优秀PPT.ppt
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1、基因工程第二章第1页,本讲稿共53页酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶 S1核酸酶Klenow酶DNA酶 Taq DNA 聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶基因工程操作中最常用的工具酶第2页,本讲稿共53页主要内容主要内容1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 2 DNADNA连接酶连接酶3 3 DNADNA聚合酶聚合酶4 4 修修 饰饰 酶酶5 5 小小 结结第3页,本讲稿共53页酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列,切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作
2、DNA探针;2 合成cDNA第二链;3 填补双链DNA 3凹端;4 DNA测序。Taq DNA 聚合酶聚合酶链式反应(PCR)多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化,制末端标记探针末端转移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应,合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第4页,本讲稿共53页1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.1 引引 言言1.2 命命 名名1.3 分分 类类1.4 活性及影响因素活性及影响因素Home第5页,本讲稿共53页核酸酶核酸酶(Nuclease):通过
3、切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键,导致核通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键,导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。(1)按作用对象分)按作用对象分:DNAase&RNAase(2)按断裂核酸分子不同方式分:)按断裂核酸分子不同方式分:Endonuclease&Exonuclease 1.1 引言引言两个概念两个概念第6页,本讲稿共53页限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restriction endonuclease):指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸序列,分子中特定核苷酸序列,并在识别序列内或附近特异切割双链并在识别序列内
4、或附近特异切割双链DNADNA的核酸的核酸内切酶。内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制限制-修饰修饰系统系统(Restriction-Modification System)。Back第7页,本讲稿共53页1.2 命命 名名命名原则:命名原则:第一个字母第一个字母(大写(大写,斜体斜体):):该酶来源的微生物该酶来源的微生物属名属名;第二、三个字母第二、三个字母(小写、(小写、斜体斜体):微生物):微生物种名种名;若该微生物有不同的若该微生物有不同的变种和品系变种和品系,再加上该变种和品系的,再加上该变种和品系的第一个字母第一个字母(大写)(大写)若从同一微
5、生物发现多种限制性内切酶,则依照发现和分离的若从同一微生物发现多种限制性内切酶,则依照发现和分离的先后先后顺序用罗马字母表示顺序用罗马字母表示。例如:例如:EcoR 从大肠杆菌从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为株分离的第一种限制酶命名为EcoR,其中其中E 代表属名(代表属名(Escherichia),co 代表种名(代表种名(coli),R 代表株系代表株系(RY13),),代表该菌株中首次分离到。代表该菌株中首次分离到。Back第8页,本讲稿共53页1.3 分分 类类1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶
6、Back第9页,本讲稿共53页1.3.1 1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:限制、修饰限制、修饰特点:特点:需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助辅助因子;因子;识别位点和切割位点不一致,无识别位点和切割位点不一致,无固定切割位点;固定切割位点;应用:应用:不常用。不常用。Back第10页,本讲稿共53页1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:限制、修饰限制、修饰特点:特点:需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助因子;辅助因子;特异切割,切割位点在距识别位点特异切割,切割位点在距识别位点33端
7、端24-26 bp24-26 bp处。处。应用:应用:数量很少,无实际作用。数量很少,无实际作用。Back第11页,本讲稿共53页1.3.3 1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶功能:功能:识别并特异切割识别并特异切割DNADNA分子。分子。即通常所指即通常所指DNADNA限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶;反应特点:反应特点:仅需仅需 MgMg2+2+作催化反应辅助因子,能作催化反应辅助因子,能识别双链识别双链DNADNA特殊序列,并可特异切割特殊序列,并可特异切割DNADNA,产,产生特异片段;生特异片段;应用:应用:种类繁多,分子克隆中最为常用种类繁多,分子克隆中最为常用第12页,本
8、讲稿共53页(1)基本特性基本特性识别长度为识别长度为4-84-8个核苷酸的特异序列;个核苷酸的特异序列;许多识别序列具许多识别序列具回文结构回文结构(两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列),如,如HinHind d 的识别序列:的识别序列:5 AAGCTT 35 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCGAA 5切割产生末端有切割产生末端有粘端粘端 (cohesive/sticky end)(cohesive/sticky end)如如BamBamH I(GGATCC)H I(GGATCC)和和平端平端 (blunt end)(blunt end)如如SmaSma I(CCC
9、GGG)I(CCC GGG)第13页,本讲稿共53页粘性末端粘性末端(1)3-OH单链延伸的粘性末端单链延伸的粘性末端.如:如:Pst 5-CTGCA G-3 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5 3-G ACGTC-5(2)5-P单链延伸的粘性末端单链延伸的粘性末端.如:如:EcoR 5-G AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 平末端平末端 如如:Sma 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5第14页,本讲稿共53页EnzymeRecognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBa
10、mH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 第15页,本讲稿共53页(2)同功异源酶同功异源酶(isoschizomer)来源不同但能识别
11、和切割同一位点的酶。又来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。称同裂酶。如:如:BamH I(GGATCC)和和Bst I(G GATCC)注:有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基注:有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。化碱基的敏感度有所不同。第16页,本讲稿共53页(3)同尾酶(同尾酶(isocaudamer)识别序列不同,但产生相同粘性末端的限制酶。识别序列不同,但产生相同粘性末端的限制酶。如:如:BamH I:GGATCC Bgl II:AGATCTBack第17页,本讲稿共53页1.4 1.4 活性及影响因素活性及影响因素(1)活性大小:酶对活性大小:酶
12、对DNA水解程度不同。水解程度不同。(2)酶的活性单位:酶的活性单位:指指1g 纯的指定纯的指定DNA在指定缓冲液中,于在指定缓冲液中,于37(最适最适温度更准确温度更准确)酶解)酶解1 h完全酶解完全酶解DNA中所有中所有同一限制同一限制性内切酶位点性内切酶位点所需的酶量。所需的酶量。第18页,本讲稿共53页(3)影响因素影响因素 DNA模板的纯度模板的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应温度酶切反应温度 DNA的分子结构的分子结构 缓冲液缓冲液Back第19页,本讲稿共53页2 DNA连接酶连接酶2.1 定义及功能定义及功能2.2 种类及作用机理种类及作用机理2.3 使用时的注意
13、事项使用时的注意事项Home第20页,本讲稿共53页2.1 定义及功能定义及功能 DNADNA连接酶(连接酶(DNA ligaseDNA ligase):):可使一段可使一段DNA 3-OHDNA 3-OH末端和末端和5-P 5-P 末端形末端形成成3,5-3,5-磷酸二酯键,把两磷酸二酯键,把两DNADNA片段连在片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。一起封闭双链上形成的切口的酶。第21页,本讲稿共53页OH P53355335DNA ligaseDNA ligase DNA ligase 连接缺刻连接缺刻(nick)(nick)Back第22页,本讲稿共53页 两类两类:T4 DNA连接酶
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