蛋白质和酶的分离与纯化.pdf

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1、蛋白质和酶的别离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物 学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞 中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从 成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的 别离方法。目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的别离纯化方法基本是采用蛋白质的 别离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的别离纯化比一般的蛋白质要求 更高。一、质别离纯化的一般原则 1.原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作

2、、安全的原料。蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2.破碎方法：(1)机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。如：捣碎法、研磨、匀桨法(2)物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。如：反复冻融、渗透压、超声破碎(3)化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的外表活性剂 Triton和Tween(4)酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3.目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4.先粗后细，分级别离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如：盐 析、离心、有机

3、溶剂沉淀等。精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如：离子交换层析、分子筛、吸附层 析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。5.防止蛋白质的变性pH、适合的温度和缓冲体系等 二、常用的蛋白质的别离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计别离方法。一根据蛋白质的溶解度不同进行别离 1.蛋白质盐析 蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm,为胶粒范围之内。蛋白质的外表电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称 为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度到达一定以后，蛋白质水化

4、膜被破坏，电荷被中和，蛋白质 的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节 盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而到达别离的目的。常用的中性盐：硫酸铉、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中最常用的是硫酸铉，它的优点是温度系数小，溶解度高 25 C时的饱和度为 4.1mol/L，即767g/L;0C时的饱和度为 3.9mol/L,即676g/L；在这一溶解度范围内，许多 蛋白都可以盐析出来；另外，硫酸铉不容易引起蛋白质变性；不同浓度硫酸铉 pH在之间，可以结合等电点进行别离纯化，沉淀效果更好。影响盐析

5、的因素：温度：pH:蛋白质浓度：盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐，否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。2.等电点沉淀法 蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时，蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小，蛋白的 溶解度下降，容易发生沉淀，因此，可以调节溶液的 pH,使其到达目的蛋白的等电点，使 之沉淀而别离。但是，此方法很少单独应用，一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应 用效果更好。3.有机溶剂沉淀法 有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大，互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。优点：易于进一步的别离，不用脱盐 缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的别离 常用的

6、有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。二根据蛋白质分子大小进行别离 1.透析与超滤 透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤是利用压力和离心力，促使大 小不等的分子通过滤过膜，两者都是根据化合物的分子量进行别离的一种方法，可选择不同 孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行别离的一种层析方法。也叫凝胶 过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。常用的凝胶材料：葡聚糖凝胶Sephadex)：是由葡聚糖交联而成，具有良好的化学稳定性，耐高温 120 C，型号多，可用于各种物质的别离和纯化。琼脂糖凝胶Sepharose)：是一种天然多孔凝胶，孔径大，适用于

7、大分子量分子的 别离。聚丙烯酰胺凝胶：是人工合成的凝胶，交联度不同，孔径不同，可用于各种蛋白的 别离。缺点是强酸会使凝胶的酰胺键破坏。三根据蛋白质带电性质进行别离 1.电泳法 各种蛋白质在同一 pH条件下，因为分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而 彼此别离。2.离子交换层析法 是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的的亲和力不同而到达别离目的的一种层 析别离方法。离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不溶性高分子化合物，这些基团能与 溶液中的其它阳离子或阴离子进行可逆的交换。按活性基团性质不同：阳离子交换剂 阴离子交换剂 按母体物质种类不同：离子交换树脂：小分子量蛋白质别离 离子

8、交换凝胶：各种分子量蛋白质别离 离子交换纤维素：各种分子量蛋白质别离 阳离子交换 阳离子交换剂中含有酸性基团，能解离出氢离子，与样品溶液中的阳离子进行交换。强酸型阳离子交换剂：磺酸R-SO3-H 弱酸型阳离子交换剂：磷酸 R-HPO3-H 短酸R-COO-H 酚羟基R-O-H R-SO-3-H+Na+-R-SO-3-Na+H+阴离子交换 3 3 阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离子，与样品溶液中的阴离子进行交换。强碱型阴离子交换剂：季胺 R-N+(CH3)3-OH-弱碱型阴离子交换剂：伯胺(R-N+HH2-OH-)仲胺(R-N+HCH 3H-OH-)叔胺R-N+(CH3)2H-OH-H

9、+基架一-E+活性基团 _-H+R-N+(CH3)3-OH-+Cl-R-N+(CH3)3-Cl-+OH-四根据蛋白质特异性进行别离-亲和层析 亲和层析是利用生物分子与配体之间具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子别离纯 化的技术。固定相：上述提到的凝胶或树脂结合上配体。优点：选择性好，纯化步骤简单，一次就可到达很高的纯化倍数。缺点：价格昂贵，处理量少，不适合大规模应用，洗脱剂要求高，无通用性。总之，根据拟别离的蛋白质的理化性质、防止变性以及样品情况和实验条件选择最正确 方法。有时往往不止用一种方法进行别离纯化，而是选择几种适当的方法进行别离，力求到 达纯化和高产的目的。-+l OH-基架-+i

10、OH一活性基团+OH-实验一-球蛋白的别离纯化、实验目的 掌握蛋白质别离纯化的基本方法和步骤。二、原理 丫-球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质，统称为免疫球蛋白 immunoglobin,Ig。按其结构和免疫化学性质的差异分为五类。分别为 IgG,IgA,IgM,IgD,IgE,其中 IgG 占 70%。血清中有70余种蛋白质，本实验的目的是要从 70余种血清蛋白中别离出丫-球蛋白。1.粗分，采用饱和硫酸铉盐析法，如果蛋白质溶液体积大，要求到达的硫酸铉饱和度在 50%以上时，可在蛋白质混合溶液中直接加入硫酸铉试剂如果蛋白质溶液体积小，要求到达的硫 酸铉饱和度在 50%以下时，可采用饱和硫酸

11、铉溶液法，饱和硫酸铉溶液的加入量按下式计 算：V=V0C2-C1/(100-C2)或者是 V=V0C2-C1/(1-C2)V:应加入饱和硫酸铉溶液的体积；V0:蛋白质溶液的原始体积；C1:原溶液的硫酸铉饱和度；C2:要到达的硫酸铉饱和度。硫酸铉盐析法可使蛋白质纯度提高 5倍，而且可以除去核酸等杂质。2.除盐：采用透析法使硫酸铉除去。3.精制：采用阴离子交换层析法 利用阴离子交换纤维素层析其优点是：具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅 速扩散，吸附量大；具有亲水性，用温和的条件可以洗脱，不易引起蛋白质的变性或酶的失 活；具有多孔性，外表积大，交换容量大，回收率高，可用于别离和制备。4.纯度

12、鉴定：采用醋酸纤维素薄膜电泳。三、试剂和器材 1试剂 正常血清人、兔、狗 饱和硫酸铉溶液 0.0175mol/L 磷酸缓冲液 1.0mlpH6.3 DEAE-纤维素 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液，与氨氮反应生成淡红棕色的化合物 410-425nm)。20%磺柳酸试剂 2.器材 层析柱及支架 白色和黑色比色板 透析袋及细线 烧杯2个、试管20支 吸管1个 四、操作步骤 1.取少许血清作为A样。2.盐析：取2ml血清加2ml生理盐水于离心管中，混匀后缓慢滴加饱和硫酸铉溶液 4ml,边加边混，室温放置10min,3000 rpm,离心10min,小心除去上清，沉淀加0.0175mol/L 磷酸

13、缓冲液1.0mlpH6.3复溶。3.透析除盐：用细线扎住透析袋一端，将溶解的-球蛋白溶液倒入透析袋内，用线扎紧透 析袋另一端，放入一大烧杯中，加入蒸储水进行透析，每隔 10min用纳氏试剂在白板上 检测烧杯中的NH4+，并更换蒸储水直至检测不到 NH4+为止，留取透析袋内液体 2滴，作为B样。4.DEAE-纤维素离子交换层析：装柱：取层析柱加入蒸储水，观察水流是否通畅，然后将层析柱垂直固定到支架上，关 闭下端出口，将处理再生后的 DEAE-纤维素悬液搅拌均匀后缓慢倒入层析柱，使柱床高 度到达10-15cm。平衡：打开柱的下端出口，用 3个柱床体积的0.0175mol/L磷酸缓冲液pH6.3平衡

14、后 关闭柱的下端出口。上样：将透析脱盐后的蛋白质溶液缓慢加到 DEAE-纤维素柱床上，开下端出口，使样品 进入柱床。洗脱：用0.0175mol/L磷酸缓冲液pH6.3洗脱蛋白，并且立即收集洗脱液，流速为 10滴/min，每2min收集1管，按顺序排列。洗脱液中蛋白质的检测：取黑色比色板或干净的试管一个，按洗脱管顺序分别取 1滴于 其中，然后加入20%磺柳酸试剂1滴，出现白色浑浊或沉淀即为蛋白质析出，记录并估 计各管的蛋白质浓度，取浓度最高的一管作为 C样。五、实验注意事项 1.硫酸铉缓慢滴加，防止形成瞬间高浓度，导致杂蛋白共沉。2.离心前试管要平衡，对称放入离心机内，开机和关机要缓慢加速和减速

15、。3.透析时两端要扎紧，不要扎段，10min左右换水一次，否则容易导致透析袋内样品稀释。4.装柱时不能分层，不能进入气泡，转好后用上样缓冲液平衡。5.样品进入柱床后再加洗脱缓冲液，否则会导致样品稀释。6.洗脱时流速不要太快，否则也会导致洗脱液中的蛋白质稀释而检测不出。实验二-球蛋白的鉴定 一、实验目的 掌握蛋白质的电泳鉴定方法和步骤。二、原理 电泳是在外界电场的作用下，带电物质向所带电荷相反电极方向的移动，由于蛋白质所 带电荷不同，迁移速度不同而彼此别离。影响电泳的主要因素有溶液的 pH、电场强度、电 泳液的离子强度、电渗的影响，下表是血清 5种蛋白质的理化参数。5种蛋白质的理化参数 分类 P

16、I MW Alb a 1 a 2 3 Y 三、试剂和器材 1.试剂 巴比妥缓冲液pH8.6。氨基黑10B染色液。漂洗液 2.器材 电泳仪及电泳槽 烧杯、培养皿 滤纸和镶子 醋酸纤维素薄膜 四、操作步骤 1.取膜：每组取3张膜，吸干水分，做好标记;2.点样：距边缘1cm处，在粗糙面分别点 A,B,C样；3.电泳：粗糙面向下置于电泳架上，平衡 5min，通电，恒压 160-180V电流强度约为 0.4mA/cm，40-60min,关闭电源；4.染色和脱色：用氨基黑 10B染色5min，自来水冲洗，用漂洗液漂洗 2-3次。五、实验注意事项 1.点样时点样片要垂直，点样量不能太多；2.取放点样膜时首先要关闭电源，不许带电操作。