《生物技术实验》教学大纲(本科)_2.pdf

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1、77 生物技术实验 一、课程简介 生物技术实验是基础医学实验教学的重要组成部分，内容涵盖分子生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、医学免疫学等学科领域中常用的基本操作技术。通过生物技术实验教学，使学生掌握了蛋白质分离纯化与含量测定、DNA 扩增技术、抗原抗体反应等技术原理和基本操作，加深学生对理论课内容的理解，引导学生理论联系实际，培养学生的实验技能，从事科学研究的意识和严谨的科学态度，提高学生实验动手能力和解决问题的能力，为将来临床课程的学习与科学研究打下基础。二、实验教学内容 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 基本内容：聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的

2、聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH 的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度 12mm），然后再进行电泳分离。基本要求：掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。2.葡聚糖凝胶层析分离蛋白质 基本内容：凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部（阻滞作用小）而沿凝胶颗粒间隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部（阻滞作用大

3、），流程长，流速缓慢，最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。基本要求：掌握葡聚糖凝胶层析分离蛋白质的方法，了解核酸蛋白检测仪及部分收集器的工作原理和使用。3.Lowry 氏法测蛋白质含量 基本内容：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。在 500 nm 处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。基本要求：学习 Lowry 氏法测定蛋白质的原理和方法，掌握分光光度法。4.人类非显带染色体核型分析 基本内容：利用显微照相装置拍

4、摄人类非显带染色体的图像，并且将其放大成染色体照片：然后根据国际上统一的标准，按染色体的长短、着丝粒的位置、随体的有无等指标，将人类的 46 条染色体分成 7 个组并编上号，最后再将染色体剪贴到专门的实验报告单上，从而制成染色体核型（karyotype）图，并检查正常与否。这个过程就称为核型分析。利用核型分析可以检查人体的染色体数目是否正常，并可发现较大的染色体畸变以及判定性别等。基本要求：熟悉正常人类染色体的数目及形态特征，掌握非显带染色体的核型分析方法。5.X 染色质制备与观察 基本内容：正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即 X 染色质。通过采取口腔黏膜细胞作为

5、检查材料，经染色后可进行观察。78 基本要求：熟悉 X 染色质标本的制作方法，掌握细胞核染色方法。6.小鼠骨髓染色体制作及观察 基本内容：小鼠骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞的细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色原始等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。基本要求：掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程、原理。7.PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 基本内容：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用 DNA 聚合酶依赖于 DNA 模板的特性，在体外模拟 DNA 的复制过

6、程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的 DNA 扩增数百万倍。基本要求：了解 PCR 技术的原理，掌握PCR 技术的程序和步骤。8.单双扩散 基本内容：用一定浓度的琼脂制成凝胶后，其内部形成一种多孔的网状结构，可允许大分子物质通过。可溶性抗原与抗体在琼脂糖凝胶自由扩散后形成沉淀。基本要求：掌握抗原抗体定性沉淀反应原理，了解IgG 等免疫球蛋白的定量检测技术。9.对流免疫电泳 基本内容：对流免疫电泳是双向琼脂扩散和电泳技术相结合的实验技术。抗原在碱性缓冲液中带负电，向正极移动；抗体蛋白质较大，负电荷少，借电渗作用缓慢移向负极，在适当的条件下，

7、可形成抗原抗体反应而出现沉淀。基本要求：掌握抗原抗体在电场中的反应条件；熟悉对流免疫基本技术。10.血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集 基本内容：用胶体金标记技术，检测尿中有无 HCG。首先将鼠抗人 HCG 的单克隆抗体（一抗）吸附在胶体金颗粒上（胶体金呈紫红色散在颗粒状，肉眼可见）并松弛地附着在 A 处。鼠抗人 HCG（一抗）及兔抗鼠 Ig（二抗）分别吸附在检测线 B 处及阳性对照线（C 处）的硝酸纤维膜上。当尿液通过毛细作用上行时，尿中的 HCG 与A 处的抗 HCG 胶体金结合，并且 HCG抗 HCG胶体金继续上行至检测线 B 处，并与 B 处的抗 HCG 发生反应，形成双抗体夹心免疫复合

8、物，抗体 Fc 段标有胶体金，即成清晰的紫红色。基本要求：通过检测尿中有无 HCG，掌握胶体金技术的原理。11.免疫荧光实验 基本内容：根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，与相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的抗原抗体复合物携带上一定量的荧光素，利用荧光显微镜可看出发出荧光的抗原抗体的结合物。基本要求：了解免疫荧光实验的基本原理，掌握荧光免疫基本实验技术。12.小鼠巨噬细胞吞噬实验 基本内容：吞噬细胞分小吞噬细胞、大吞噬细胞。前者为外周血中的中性粒细胞，后者包括外周血的单核细胞和组织中的巨噬细胞。检测其功能，有助于疾病的诊断和判断机体非特异性免疫水平。基本要求：掌握大吞噬

9、细胞吞噬功能检测方法，熟悉机体非特异免疫功能。13.ELISA 法检测白细胞介素 2 基本内容：IL-2 主要是由活化的 T 细胞产生，在机体的免疫应答中发挥主要作用。它有较强的自分泌性和旁分泌性，能促进T 细胞 NK 细胞增殖及活化、诱导 LAK 和 TIL 细胞的产生，79 参与 B 细胞增殖及活化等作用。IL-2 产生水平反映了 T 细胞的功能。本试验是采用两株识别不同表位的抗 IL-2mAb，其中一株作为包被抗体，以识别和结合待检标本中的 IL-2，另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体上的 IL-2 的另一表位结合，并催化底物呈色。基本要求：掌握用酶联免疫吸附的方法检验可溶性抗原分子的

10、技术，了解细胞因子的检测手段。14.温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）基本内容：本实验是观察在不同温度、pH 以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。借以验证各种因素对酶活性的影响。唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。麦芽糖具有还原性。根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。基本要求：了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响。三、参考资料 生物化学与分子生物学第八版.查锡良、药立波主编.人民卫生出版社.2013 年 8 月出版 医学免疫学第六

11、版.曹雪涛主编.人民卫生出版社.2013 年 3 月出版 医学遗传学第三版.傅松滨主编.北京大学医学出版社.2013 年 12 月出版 医学生物化学与分子生物学实验技术第二版.王玉明主编.清华大学出版社.2017 年 8 月出 版 医学免疫学实验指导第一版.王大军、车昌燕主编.科学出版社.2013 年 3 月出版 医学细胞生物学与遗传学实验指导第一版.王大军、韩梅主编.科学出版社.2013 年 2 月出 版 四、学时分配 序号 实验项目名称 实验类型 实验学时 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 基础类 8 2 葡聚糖凝胶层析分离蛋白质 综合类 4 3 Lowry 氏法测蛋白质含量 基础类 4 4 人类非显带染色体核型分析 基础类 4 5 X 染色质制备与观察 基础类 4 6 小鼠骨髓染色体制作及观察 综合类 4 7 PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 基础类 4 8 单双扩散 基础类 2 9 对流免疫电泳 基础类 2 10 血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集 基础类 4 11 免疫荧光实验 基础类 4 12 小鼠巨噬细胞吞噬实验 综合类 4 13 ELISA 法检测白细胞介素 2 综合类 4 14 温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 基础类 4 合计-56