茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程(T-HSPP 0005—2022).pdf

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1、 T/HSPP00052022 茄科植物携带茄科植物携带柑橘裂皮类病毒柑橘裂皮类病毒检测技术规程检测技术规程 Code of Practice for Detection of Citrus exocortis viroid carried by Solanaceae plants (发布稿)2022-10-10 发布 2022-11-10 实施 湖 北 省 植 物 保 护 学 会 发布ICS 65.020.20 CCS B16 团体标准 T/HSPP00052022 I 目次 前言.II 1 范围.-1-2 规范性引用文件.-1-3 术语和定义.-1-4 柑橘裂皮类病毒分类信息.-1-5 仪

2、器和试剂.-1-仪器设备.-1-主要试剂.-1-6 检测流程图.-1-7 检测方法.-1-样品制备.-2-7.1.1 种子类.-2-7.1.2 种苗类.-2-RNA 提取.-2-RT-PCR 检测.-2-分子杂交.-2-结果判定.-3-8 留样保存与结果记录.-3-留样保存.-3-结果记录.-3-建档.-3-附 录 A（参考性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息.-4-附 录 B（参考性附录）核酸提取方法.-5-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法.-6-附 录 D（规范性性附录）柑橘裂皮类病毒检测流程图.-8-T/HSPP00052022 II 前言 本文件按照GB/T 1.1-2020 标准化工作

3、导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由武汉海关技术中心提出。本文件由湖北省植物保护学会归口。本文件起草单位：武汉海关技术中心、武汉理工大学、南京海关动植物与食品检测中心、华中农业大学、武汉中地检测技术有限公司。本文件主要起草人：王琴、张建坤、许剑涛、孙俊、徐文兴、李倩、李乔、徐雪、华益、赵梅荣、刘振、郑鑫浩、孙民琴、李彬、吴翠萍、王振华。T/HSPP00052022 -1-茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了柑橘裂皮类病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃

4、薯等茄科植物种子及种苗中柑橘裂皮类病毒的检测和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 柑橘裂皮类病毒分类信息 中文名：柑橘裂皮类病毒 学名：Citrus exocortis viroid 类病毒名及缩写：citrus exocortis viroid，CEVd 分类地位：马铃薯纺锤形块茎类

5、病毒科（Pospiviroidae），马铃薯纺锤形块茎类病毒属（Pospiviroid）。柑橘裂皮类病毒的基本信息参见附录A。5 仪器和试剂 仪器设备 电子天平（感量0.001 g）、植物培养箱、研钵、高压灭菌锅、纯水仪、PH仪、旋涡振荡器、高速冷冻离心机、台式小型离心机、恒温加热器、生物安全柜、制冰机、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪、各种量程的可调配移液器（2.5 L，10 L、20 L，200 L，1000 L）、常规冰箱、超低温冰箱等。主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。商品化Tr

6、izol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、反转录酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、引物和探针、Tris-乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。6 检测流程图 柑橘裂皮类病毒检测流程图见附录D。检测过程中防扩散、防污染的措施按照SN/T 2964中的规定执行。7 检测方法T/HSPP00052022 -2-样品制备 7.1.1 种子类 每份送检样本中选取100200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，2025、12 h/12 h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1 g5 g，置于去RNA酶的研钵中

7、，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。7.1.2 种苗类 对于有症状的种苗类样品，选取全部表现症状的叶片；对于无症状的种苗类样品，随机选取。取100 g200 g叶片置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。RNA 提取 取制备好的检测样品100 mg，按照常规Trizol法提进行总RNA提取；以感染CEVd的茄科植物样本作为阳性对照，以无CEVd茄科植物样本作为阴性对照，同时进行提取。具体操作步骤参见附录B。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR 检测 7.3.1 cDNA 合成 0.2 mL PCR管中加入DEPC处理去离子水10 L、模板RNA 3

8、L（50 ng200 ng），随机引物1 L，95（或沸水）水浴7 min，迅速置冰上冷却3 min；然后加5 反转录缓冲液4 L、10 mmol/L dNTPs、40 U/L RNAase抑制剂（Rnasin）0.5 L、200 U/L 反转录酶（M-MLV）0.5 L，混匀后37水浴1 h；反转录结束后瞬时离心，95（或沸水）水浴5 min，冰浴3 min，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。7.3.2 PCR 扩增 反应体系：0.2 mL PCR管中加入10 PCR buffer（含Mg2+）2.5 L，dNTPs（10 mmol/L）2 L，引物（均为10 mol

9、/L）各1.0 L（见表1），5 U/L Taq酶0.5 L，模板cDNA3 L，加DEPC处理水至总体积25 L。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表 1 PCR反应特异性引物及序列 引物名称 引物序列（5-3）产物大小（bp）CEVd371F CCGGGGATCCCTGAAGGA 371 CEVd371R GGAAACCTGGAGGAAGTCG 反应程序：95 5 min；95 30 s，56 30 s，72 30 s，35个循环；72 10 min。也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。7.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 制

10、备1.5%琼脂糖凝胶，取1 L加样缓冲液与5 LRT-PCR反应产物混匀进行点样，采用110V电泳35 min后，凝胶成像检测扩增产物。7.3.4 测序分析（可选）对RT-PCR扩增产物进行测序，将测得序列与GenBank数据库中已知的CEVd序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交 采用Roche地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记，制备地高辛标记的CEVd RNA探针，放置于-20备用。取3 L样品核酸，经变性后点于带正电荷的尼龙膜上，晾干后在交联仪上交联3 min。交联固定后的尼龙膜在杂交炉上68进行预杂交1 h，然后加入2 LRNA探针杂交10 h。杂交后进行洗膜，最后按照化学发

11、光法进行杂交检测。具体操作步骤参见附录C。T/HSPP00052022 -3-结果判定 对照成立的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有柑橘裂皮类病毒；样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的CEVd序列相似性达90%以上，可判断样品携带柑橘裂皮类病毒；样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带柑橘裂皮类病毒。8 留样保存与结果记录 留样保存 检出柑橘裂皮类病毒的种子、生长苗木样品以及7.1剩余制样于-80冰箱内保存。样品应保存至少6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果

12、记录 RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档 建立实完整的实验档案，包括样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法、结果及实验人员签字等。-4-A A 附 录 A（资料性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息 A.1 寄主范围 芸香科（Rutaceae）、马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）、茄子（Solanum melongena）、矮牵牛（Petunia hybrid）、蚕豆（Vicia faba）、胡萝卜（Daucus carota）、葡萄（Vitis vinifera）、碧冬茄（P

13、etunia hybrid）、菊科（Compositae）、三七草属（Gynura）、柑橘属（Citrus）、香橼（Citrus medica）等。A.2 地理分布 目前已报道发现CEVd的国家有澳大利亚、斐济、汤加、新西兰、非洲南部、俄罗斯、法国、葡萄牙、西班牙、意大利、土耳其、巴基斯坦、菲律宾、马来西亚、日本、沙特阿拉伯、泰国、以色列、印度、越南、中国等。A.3 传播途径 通过嫁接、花粉、种子和刀具机械传播。远距离通过种苗调运传播。A.4 病害症状 柑橘裂皮类病毒在马铃薯及番茄上引起的症状与马铃薯纺锤块茎类病毒相似，在马铃薯造成纺锤状块茎，在番茄上的症状为簇顶。症状的严重性、潜伏期及矮化出

14、现的时间和程度主要由于田间存在不同的CEVd株系。CEVd的株系是根据在不同的砧木/接穗的柑橘上的症状严重程来划分的，弱毒株系存在于叶片中，引起矮化症状，而强毒株系则引起裂皮症状。A.5 CEVd基因组特征 CEVd基因组为单链环状RNA分子，基因组大小约371 nt，GC含量高，分子内部碱基配对形成稳定的杆状或拟杆状二级结构，在一定条件下可形成发夹状变形结构。CEVd基因组包含5个功能区：左末端区(TL)、致病区(P)、中央保守区(C)、可变区(V)和右末端区(TR)。-5-附 录 B（资料性附录）核酸提取方法 B.1 核酸提取相关试剂 DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水500 mL，加

15、入500 L DEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：称取12.11 g Trisbase，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：称取18.61 g Na2EDTA2H2O，加80 mL处理超纯水溶解，用约2 g NaOH调pH 值至8.0，加DEPC 100 L，定容至100 mL，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10TE（pH8.0）：取1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL和0.5 mol/

16、L EDTA（pH 8.0）2 mL，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存。B.2 核酸提取 称取7.1制备的检测样品100 mg，转入已灭菌的去RNA酶离心管；立即加入1 mL Trizol，涡旋振荡15 s，室温静置15 min；加400 L氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2 min，4 12000 r/m离心15 min；取上清于新的离心管中，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，-20沉降1h；12000 r/m离心15 min；弃上清，沉淀中加1 mL 预冷的75%酒精，上下颠倒10次，12000 r/m离心5 min，弃上清；瞬间离心20 s

17、，吸去多余液体，室温干燥5-10 min，加30 L DEPC处理的去离子水溶解，-80 冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。-6-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法 C.1试剂与材料 C.1.1核酸杂交相关试剂 20SSC：称取 175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠2H2O，溶解于 800 mL 去离子水，用 HCl调 pH 值至 7.0，最后用定容至 1 L，高温高压灭菌后室温保存；50Denhardts 溶液：称取 1 g Ficoll 400，1 g PVP-40，1 g BSA，溶解于 80 mL 去离子水，定容至 100 mL，过滤除菌及杂质后-2

18、0 贮存；预杂交液：6 SSC、5 Denhardt 溶液、50%(w/v)Formamide、0.5%(w/v)SDS、100 g/mL 鲑鱼精 DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入 DIG-RNA 探针，稀释成适当浓度；封闭液：将 0.73 g NaCl，0.24 g Na2HPO4，0.1 g NaH2PO4，5 g SDS 溶于 80 mL 水中，定容至 100 mL，过滤除菌后室温保存；洗涤液 I：为 1/10 稀释的封闭液；洗涤液 II：将 0.24 g Trisbase，1.16 g NaCl，0.4 g MgCl2溶于 160 mL 水中，用 HCl 调pH 至

19、 9.5，定容至 200 mL，过滤除菌后室温保存；MOPS 缓冲液（10）:200 mmol/L MOPS(pH7.0)、50 mmol/L NaAc、10 mmol/L EDTA；Maleic acid 缓冲液：100 mmol Maleic acid、150 mmol NaCl，pH7.5；洗膜缓冲液：100 mmol Maleic acid、150 mmol NaCl、0.3%(v/v)Tween20，pH7.5；检测缓冲液：100 mmol Tris-HCl(pH9.5)、100 mmol NaCl；抗地高辛的酶标抗体：Anti-DIG-AP；CSPD：25 mmol CSPD（用前

20、稀释）；带正电的尼龙膜为 Amersham Pharmacia Biotech 公司的产品。C.2 标记探针 挑取CEVd全长cDNA正向插入的克隆质粒，用Nde 对质粒进行酶切线性化处理，获得含有目标片段的线性化重组质粒。采用 T7 RNA 多聚酶进行体外转录随机标记单链RNA探针：取1 g线性化质粒，加入4 L 5转录反应缓冲液、2 L地高辛（digoxin，DIG）标记dNTPs和2 L T7 RNA聚合酶、0.5 L RNA酶抑制剂，37标记反应2 h，反应完成后保存于-20冰箱备用。C.3 实验步骤 C.3.1 样品RNA的提取 方法同B.2。C.3.2 RNA斑点印迹杂交 -7-1

21、）取 3 L RNA 加 7L 变性缓冲液(33%甲醛、50%去离子甲酰胺和 1 MOPS)，65水浴 15 min，冰浴 5 min，促使核酸变性；2)然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上，每次 3 L，点好后将膜晾干；3）将膜正面朝上置于胶联仪（Hoefer-Uvc500，Amersham Biosciences Corp.）内，在紫外光强度 1200100 J/cm2条件下胶联固定 3 min；4）将膜用 6SSC 预湿后，放入预杂交液中，在杂交炉（Fisher Scientific International Inc.）68预杂交 1 h；5）然后将探针煮沸 5 min，迅速冰上冷却

22、5 min，加入到杂交缓冲液中，65杂交 10 h；6）杂交结束后，将膜取出，用 20 mL40 mL 含 2SSC 和 0.1%SDS 溶液在室温洗膜 5 min，重复一次；7）用 20 mL40 mL 含 0.1SSC 和 0.1%SDS 溶液在 68 下洗膜 15 min，重复一次；8）将膜放入杂交袋中用于检测。C.3.3 杂交检测 采用 Roche 地高辛检测试剂盒在室温（2025）条件下进行杂交结果的检测。按 100 cm2膜面积计算试剂用量。1）洗膜后，用洗液冲洗杂交膜；将膜放入在 100 mL 封闭液内封闭 30 min；2）利用封闭液按 1：10000 稀释抗体，将膜放入 20

23、 mL 抗体溶液内孵育 20 min；3）加 100 mL 洗膜液，室温洗膜 15 min，重复 1 次；4）加 20 mL 检测液，室温孵育 2 min5 min，重复 1 次；5）杂交面朝上，加 2 mL CSPD 使其均匀铺在膜上，室温孵育 5 min，取出膜沥干溶液，用保鲜膜包好；6）5 min15 min 后置于化学发光检测仪内检测光信号。C.4 结果判定 阴性对照无或弱的杂交信号，阳性对照有强的杂交信号，则结果可靠；杂交信号显著比阴性对照强的判定为阳性样品。-8-附 录 D（规范性性附录）柑橘裂皮类病毒检测流程图 D.1 柑橘裂皮类病毒检测流程图 图D.1 柑橘裂皮类病毒检测流程图 与 GenBank 数据库中已知的 CEVd 序列进行相似性比对分析，相似性达 90%以上 检出柑橘裂皮类病毒 检测样品 RT-PCR 检测和分子杂交检测 阳性检测 阳性检测 测序分析验证 RT-PCR 检测或分子杂交检测 检出柑橘裂皮类病毒