抗生素微生物检定法优秀PPT.ppt
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1、抗生素微生物检定法你现在浏览的是第一页,共134页HPLC紫外分光光度法化学滴定法效价测定你现在浏览的是第二页,共134页SH SL TH TL你现在浏览的是第三页,共134页前 言 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立至今,在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展,一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代,但由于以下原因:你现在浏览的是第四页,共134页前 言o微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗菌活性;o多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异,化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系;o许多
2、抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。所以抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位,且短期内化学分析法不可能取代微生物检定法。你现在浏览的是第五页,共134页1定义抗生素微生物检定法o抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点,以抗生素的抗菌活性为指标,来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。你现在浏览的是第六页,共134页1定义抗生素青霉素 “抗生素是微生物在代谢中产生的具有抑制它种微生物生长活动、甚至杀灭他种微生物的化学物质”。“是在低微浓度即可对某些生物的生命活性有特异抑制作用的微生物次级代谢产物及其衍生物”“抗生素是生物(包括微生
3、物、植物、动物在内)在其生命活动中产生的(或并用化学、生物或生化方法衍生的),能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。”由生物发酵改为化学合成(氯霉素)、全新结构的全合成抗生素(氨曲南)抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现、化学改造推动半合成抗生素的迅速发展 定义为1942年,链霉素的发现者Waksman定义:1929 年Flemming发现第一种抗生素()你现在浏览的是第七页,共134页1.定义抗菌活性o抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。o抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示。o在临床应用中,抗生素的抗菌活性可准确地反映抗生素的医疗价值。硫酸链霉素 798单
4、位/毫克青霉素G钠 1670单位/毫克杆菌肽 74单位/毫克你现在浏览的是第八页,共134页1.定义抗生素效价定义o“活性”重量单位o重量折算单位o特定单位你现在浏览的是第九页,共134页1.定义抗生素效价定义l“活性”重量单位:以抗生素中所含特定的抗菌(抗肿瘤细胞、抗病毒)活性部分的重量作为效价单位。如碱性抗生素,以纯碱的量作为有效部分的量;酸性抗生素,以纯酸的量作为有效部分的量。你现在浏览的是第十页,共134页1.定义抗生素效价定义o在抗生素的生产、研究和应用等方面,均以抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素的效价单位,采用活性成分的“活性”重量1g1效价单位的方法表示。o抗生素效价以“单
5、位(u)”或“微克(g)”表示。你现在浏览的是第十一页,共134页1.定义抗生素效价定义例:硫酸链霉素o抗菌活性是以链霉素效价单位表示的,其链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱的“活性”重量表示的,即1链霉素效价单位1微克链霉素碱,这里是“活性微克”而不是“重量微克”。你现在浏览的是第十二页,共134页1.定义抗生素效价定义o在制成盐类或其他衍生物后,其相应的折算效价,可以从分子量折算而得。o如:硫酸链霉素的折算效价为你现在浏览的是第十三页,共134页1.定义抗生素效价定义l重量折算单位:以特定的纯抗生素制品的某一重量为1单位而加以折算。如:青霉素G钠 以青霉素单位也称牛津单位(Oxford
6、 unit)表示其抗菌活性,最初的定义为“1个青霉素效价单位(u)为能在50毫升肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量”。你现在浏览的是第十四页,共134页1.定义抗生素效价定义o例:青霉素国际标准品o第一批青霉素国际标准品,青霉素G钠称重0.6微克为1单位,即1667单位/毫克。o第二批青霉素国际标准品,青霉素G钠称重0.5988微克为1单位,即1670单位/毫克。你现在浏览的是第十五页,共134页1.定义抗生素效价定义l特定单位:这一类抗生素大都组成成分较复杂,或还不易得到纯品,在开始生产及临床使用时,只能以一特定量的标准品(或对照品)作为1单位。如:杆菌肽国际标准
7、品 第一批杆菌肽国际标准品为55单位/毫克;第二批杆菌肽国际标准品为74单位/毫克。你现在浏览的是第十六页,共134页1.定义抗生素微生物检定法o抗生素微生物检定法可分为:(1)稀释法 (2)比浊法 (3)琼脂扩散法(管碟法和打孔法)o各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。你现在浏览的是第十七页,共134页1.定义稀释法o通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况,观察含不同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生长,从而测定抗生素最低抑菌浓度(MIC)的方法,常用于新药研制及临床药敏试验等方面。你现在浏览的是第十八页,共134页1 2 3 4 5 6 7 8 一 一
8、一 一 一 一 一 一 不同浓度的 抗生素液体培养基 浓 稀等量的试验菌菌液你现在浏览的是第十九页,共134页1.定义比浊法o通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况,利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度,从而衡量抗生素抑菌效力的方法,可用于抗生素药物的含量(效价)测定。你现在浏览的是第二十页,共134页1.定义(琼脂)扩散法o通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散,而在其表面所产生的抑菌圈的大小,衡量抗生素抑菌效力的方法,多用于抗生素药物的含量(效价)测定。你现在浏览的是第二十一页,共134页抗生素微生物检定方法比较:你现在浏览
9、的是第二十二页,共134页1.定义管碟法 l此法系根据抗生素在一定浓度范围内,对数剂量与抑菌圈直径(面积)呈直线关系而设计,通过检测抗生素对微生物的抑制作用,比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小,计算出供试品的效价。TH TL SH SL你现在浏览的是第二十三页,共134页2.原理抑菌圈的形成o两种互动作用:一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用;另一种是试验菌的生长作用。o当培养到一定时间,琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时,琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即:在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度,试验菌生长受到抑制,此处琼脂培养基成透明状;在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌
10、浓度。你现在浏览的是第二十四页,共134页2.原理量反应平行线原理o量反应平行线原理:“在属量反应的指标中,当对数剂量和反应呈直线关系,且供试品和标准品的作用性质相同时,供试品和标准品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行”。你现在浏览的是第二十五页,共134页2.原理量反应平行线原理o在抗生素微生物检定法中,一定剂量范围内,抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小呈直线关系。这就在理论上决定了,(活性)成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围内产生的两条剂量反应直线相互平行,符合量反应平行线原理的基本要求。你现在浏览的是第二十六页,共134页2.原理量反应直线o两位微生物学者HamphreyLight
11、和Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式:o该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础。你现在浏览的是第二十七页,共134页o将上述公式简化、移行,并将自然对数转换为常用对数得:o上述公式表明,抗生素总量的对数(lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系,即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质的量。你现在浏览的是第二十八页,共134页3.检定方法o分类o一剂量法(标准曲线法)o二剂量法(2 2法)o三剂量法(3 3法)你现在浏览的是第二十九页,共134页o二剂量法(2 2法):用标准品、供试品各两个剂量,根据量反应平行线原理,在相同试验条件下,比较标准品和供试品二者对微生物产生的效
12、力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定;3.1管碟法的操作步骤你现在浏览的是第三十页,共134页3.1管碟法的操作步骤 预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定你现在浏览的是第三十一页,共134页3.1管碟法的操作步骤o预试验:预试验:确定最佳的试验条件:调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等,使抑菌圈的大小符合规定:高剂量浓度溶液所致的抑菌高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在圈直径在1822mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。o高低剂量之比为2:1(如高、低剂量所致的抑菌圈差别
13、较小时,可用4:1的剂量比率)。你现在浏览的是第三十二页,共134页3.1管碟法的操作步骤o试验准备:试验准备:双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌;容量瓶、定量吸管的清洗;培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。你现在浏览的是第三十三页,共134页3.1管碟法的操作步骤o双碟底层的制双碟底层的制备:备:每只双碟加底层培养基约20ml,待培养基凝固,待用。你现在浏览的是第三十四页,共134页3.1管碟法的操作步骤o供试品、标准品溶液的制备:供试品、标准品溶液的制备:估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。你现在浏览的是第三十五页
14、,共134页3.1管碟法的操作步骤o菌层的制备:菌层的制备:菌层培养基:在培养基中添加一定量的菌悬液,振摇混匀。注意菌层培养基温度;根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量。每只双碟加入5ml菌层培养基。注意制备菌层的速度和平菌层的速度和平整度。整度。你现在浏览的是第三十六页,共134页3.1管碟法的操作步骤o滴加抗生素溶液:滴加抗生素溶液:o注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的均匀一致。每组双碟至少为8个,一般为10个。o在每个双碟的4个钢管中,对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液,其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。o按SHTHSL
15、TL顺序,分别滴加标准品和供试品高、低剂量溶液。你现在浏览的是第三十七页,共134页3.1管碟法的操作步骤o双碟的培养:双碟的培养:根据培养温度的要求在培养箱中进行培养,培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。你现在浏览的是第三十八页,共134页3.1管碟法的操作步骤o抑菌圈的测量:抑菌圈的测量:将培养好的双碟取出,打开陶瓦盖,将钢管倒入1:1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡,检查抑菌圈是否圆整,如有破圈或不圆整圈应将碟弃去,切忌主观挑选抑菌圈和双碟,是结果造成偏离。抑菌圈测量仪的使用:每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量:游标卡尺你现在浏览的是第三十九页,共134页3.1
16、管碟法的操作步骤o结果的可靠性检验及效价测定:结果的可靠性检验及效价测定:抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。你现在浏览的是第四十页,共134页3.1管碟法的操作步骤培养后的双碟你现在浏览的是第四十一页,共134页3.1结果计算及判断o可靠性检验o抗生素微生物检定法前提条件是:标准品S和供试品T各对数剂量与反应呈直线关系,且标准品S和供试品T的两条直线平行。o可靠性测验是利用生物统计方法验证标准品和供试品的量反应关系是否显著偏离直线、偏离平行。对在一定概率水平下不显著偏离直线、不显著偏离平行的实验结果,认为可靠,所得检定结果有意义。你现在浏览的是第四十二页,共134页3.1结果计算及判断o
17、以红霉素眼膏为例,红霉素标示量为0.5%,即每1g红霉素眼膏中含5000u红霉素。假设投料量为100%,那么估计效价为100%。试验采用二剂量法;剂间比为2;浓度比为1;试验菌为短小芽孢杆菌CMCC(B)63 202。你现在浏览的是第四十三页,共134页3.1结果计算及判断可靠性测验计算:可靠性测验计算:o结论:回归非常显著F27.82(P0.01)(即不显著偏离直线);偏离平行不显著F34.26(P0.05);实验结果成立。试品间 F1=0.5326 P=0.05 F=4.2600 回 归 F2=873.2370 P=0.01 F=7.8200 偏离平行F3=0.2537 P=0.05 F=
18、4.2600 P0.05 剂 间 F6=291.3411 P=0.01 F=4.7200 碟 间 F7=2.1653 P=0.01 F=3.6700 回归(F2)表示测验的量反应值是否随剂量而有规律的增加或降低。回归项变异(P0.05)不显著,则平行关系是可靠的。你现在浏览的是第四十四页,共134页3.1结果计算及判断抑菌圈测量值:抑菌圈测量值:=碟号 ds1 ds2 dt1 dt2 ym-No.1 18.13 19.24 18.09 19.63 75.09 No.2 17.85 19.41 17.96 19.60 74.82 No.3 18.14 19.55 18.09 19.89 75.6
19、7 No.4 18.05 19.83 18.10 19.75 75.73 No.5 18.07 19.98 18.21 19.70 75.96 No.6 18.15 19.37 17.88 19.52 74.92 No.7 18.19 19.46 17.97 19.63 75.25 No.8 17.93 19.85 18.06 19.94 75.78 No.9 18.09 20.04 18.35 19.67 76.15-yk 162.60 176.73 162.71 177.33 679.37-你现在浏览的是第四十五页,共134页3.1结果计算及判断效价计算:碟数 m=9 圈数 K=4 估计效
20、价 At=100%剂间比 r=2.0000 浓度比 D=1.0000 对数值 I=0.3010t表 t=2.0640 样品方差 S2=0.0263 自由度 f=24R的对数 M=0.0074 回归系数 g=0.0049 标准误差 Sm=0.0102对数比值 R=1.0173 R上限 Rh=1.0680 R下限 Rl=0.9691测定效价 Pt=101.7265%Pt上限 Ph=1067.9584 下限 Pl=969.1406平均可信限率Pt的FL%=4.86%PT的可信限FL和平均可信限率FL%可信限FL和平均可信限率FL%是反映检定结果精密度的统计量。PT的可信限是PT标准误差SM和t值(在
21、95%的概率水平下)的乘积。可信限范围(PTtSM)表示对该供试品进行100次检验,95次的结果在PTtSM PTtSM范围里。PT平均可信限率FL%:FL%=(tSM)/PT100%中国药典中,一般抗生素微生物检定平均可信限率限定在5%范围内,个别品种放宽至7%。你现在浏览的是第四十六页,共134页3.1结果计算及判断o重试判定o抑菌圈大小的要求o可靠性检验:符合可靠性检验各项规定后,才能认为试验结果可靠,方可进行效价和可信限率计算。可信限率:供试品效价测定结果(PT)的可信限率除特殊规定外,不得大于5%。实测效价与估计效价:试验计算所得效价应在估计效价的10%以内,即:试验所得效价低于估计
22、效价的90%或高于估计效价的110%,则检验结果仅作为初试,应调整供试品估计效价,予以重试。效价测定结果不符合规定时,需换人加倍复试。你现在浏览的是第四十七页,共134页o标准曲线法(一剂量法):将标准品一组剂量的对数与微生物的反应绘制成直线图,相同条件下,测得供试品对微生物的反应值,在标准品的标准曲线上查出引起该反应的抗生素的相对浓度及效力。o一剂量法一般用于制备标准曲线或测定血药浓度。3.2一剂量法你现在浏览的是第四十八页,共134页操作步骤标准曲线法o中心点浓度中心点浓度C0的选取的选取o中心点的抑菌圈直径应在1617.5mm。o剂距剂距o按等比级数选取。o一般采用1:0.8、1:0.8
23、8、1:0.85。C0C0C0CCC你现在浏览的是第四十九页,共134页操作步骤标准曲线法o分组分组o按选取的C0及剂距,一般分为8个组,即溶液浓度为C1、C2C8。o每组双碟数应不少于3个,一般可用5个,个别情况可增至10个。C0C0C0CCC你现在浏览的是第五十页,共134页操作步骤标准曲线法o点样点样o每个双碟安置6枚钢管。o在各组每个双碟6枚钢管相间隔的三个钢管内,均滴加C0标准液。o在第一组每个双碟的其余三个钢管内滴加C1的溶液,在第二组每个双碟的其余三个钢管内滴加C2的溶液o滴加药液的顺序,可从中心浓度组开始向高、低两端交叉滴加。如8个稀释度的双碟,滴加次序可为C4、C5、C3、C
24、6、C2、C7、C1及C8。C0C0C0CCC你现在浏览的是第五十一页,共134页操作步骤标准曲线法o抑菌圈的测量抑菌圈的测量o双碟在规定温度下培养一定时间后,采用抑菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径。o结果计算及可靠性检验结果计算及可靠性检验o以抑菌圈直径为横坐标,以浓度的对数为纵坐标,绘制标准曲线。o经计算得到回归直线方程o相关系数:1r0.99你现在浏览的是第五十二页,共134页3.3检定方法o三剂量法(3 3法):用标准品、供试品各三个剂量,根据量反应平行线原理,在相同试验条件下,比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。o三剂量法用于抗生素药品的仲裁或标准品的标定。你现在浏览的是
25、第五十三页,共134页操作步骤三剂量法o基本要点基本要点o中剂量点的抑菌圈直径应在1518mm。o三个剂量之比为1:0.8(1.25:1)。o点样点样o每组双碟至少为9个,一般为15个。o在每个双碟的6个钢管中,互相间隔的3个钢管分别滴加高、中、低浓度的标准品溶液,其余3个钢管内分别滴加相应的高、中、低浓度的供试品溶液。o按SHTHSMTMSLTL或THSHTMSMTLSL顺序,分别滴加标准品和供试品高、中、低剂量溶液。你现在浏览的是第五十四页,共134页操作步骤三剂量法o三剂量法双碟、钢管与抑菌圈位置图S3:标准品高剂量 S2:标准品中剂量 S1:标准品低剂量T3:供试品高剂量 T2:供试品
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