干细胞课件优秀PPT.ppt
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1、干细胞课件你现在浏览的是第一页,共73页2 In early October,a Colorado couple has a baby named Adam,whose umbilical cord stem cells could cure his six-year-old sister Mollys Fanconi anemia.20002000年十月发生在美国年十月发生在美国ColoradoColorado的一个故事的一个故事你现在浏览的是第二页,共73页3你现在浏览的是第三页,共73页4One cell is removed from an eight-cell embryo in p
2、reparation for preimplantation genetic diagnosis.你现在浏览的是第四页,共73页5Two separated blastomeres subjected to FISH analysis to check the chromosomes你现在浏览的是第五页,共73页6Genetic abnormalities detected with Vysis Inc.s MultiVysion PGT technology.你现在浏览的是第六页,共73页7一、干细胞的概念一、干细胞的概念 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。你现在浏览的是第七页,共7
3、3页8 干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域,最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域,1999年干细胞年干细胞研究被美国研究被美国科学科学杂志评为杂志评为1999年度世界十大科学之冠,年度世界十大科学之冠,2000年干细胞研究再次被年干细胞研究再次被科学科学杂志评为该年度世界十大科学成就杂志评为该年度世界十大科学成就之一。之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来,它有望解决临床组织工程是以干细胞研究为基础发展起来,它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题,进展极为迅速,已经成为干细上急需
4、的人工组织与器官问题,进展极为迅速,已经成为干细胞应用的主要方向。胞应用的主要方向。你现在浏览的是第八页,共73页9干细胞有几个主要特征干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞;干细胞能无限增殖分裂;干细胞可连续分裂几代,也可在较长时间内处于静止 状态;干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为 干细胞 或分化为特定细胞。你现在浏览的是第九页,共73页10你现在浏览的是第十页,共73页11Alternative models for stem cell development.(A)Invariant asym-metry.A stem cell(S)gives rise by asym
5、metric division to a prog-enitor(P)with a more restricted proliferation potential,which differentiates in response to extri-nsic cues.The stem cell phenotype is regulated by reciprocal short-and/or long-range signaling(thick colored arrows).(B)Populational asymmetry.Stem cells give rise to daughter
6、cells that can be either stem cells or else progenitors that differentiate along different pathways(1,2,and 3)depending on the combination of extrinsic factors to which they are exposed.ECM,extracellular matrix.你现在浏览的是第十一页,共73页12你现在浏览的是第十二页,共73页13你现在浏览的是第十三页,共73页14 1981年年Evans和和Kaufrnan及及Martin首次由小鼠
7、中分离得到首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。鼠的胚胎干细胞。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有:至今已分离得到的胚胎干细胞物种有:金黄地鼠(金黄地鼠(1988)、貂()、貂(1993)、猪()、猪(1994,1997)、鸡)、鸡(1996)、恒河猴()、恒河猴(1995)、绒猴()、绒猴(1996)。)。分离得到人的胚胎干细胞(分离得到人的胚胎干细胞(1998),),分离得到人的胚胎生殖细胞(分离得到人的胚胎生殖细胞(1998),),目前不断报道成年组织来源的的干细胞。目前不断报道成年组织来源的的干细胞。你现在浏览的是第十四页,共73页15二、干细胞的分类二、干细胞的分类按分化潜能大小来分类按
8、分化潜能大小来分类:全能干细胞(全能干细胞(Totipotent stem cell):它具有形成完整个 体的分化潜能。如受精卵,胚胎干细胞。多能干细胞(多能干细胞(pluripotent stem cell),具有分化出多种组 织细胞的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子,它可分化出至少十二种血细胞。专能干细胞(专能干细胞(multipotent stem cell),这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。你现在浏览的是第十五页,共73页16根据来源来分根据来源来分
9、:来源于胚胎来源于胚胎-胚胎干细胞胚胎干细胞 ESC (Embryonic Stem Cell)胚胎性生殖细胞胚胎性生殖细胞 EGC (Embryonic Germ Cell)来源于成体来源于成体-成体组织来源的干细胞成体组织来源的干细胞 ASC (Adult-derived Stem Cell)你现在浏览的是第十六页,共73页17根据干细胞组织发生的名称进行分类根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞胎胎干细胞造血干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞成骨干细胞成骨干细胞内胚层干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞胰腺干细胞你现在浏览的是第十七页,
10、共73页18三、胚胎干细胞三、胚胎干细胞你现在浏览的是第十八页,共73页19 1998年美国有两个小组分别培养出了人多能(pluripotent)干细胞:James A.Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是:人卵体外受精后,将胚胎培育到囊胚阶段,提取 inner cell mass细胞,建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性,证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法,每个胚胎可取得1520个细胞用于培养。John D.Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干
11、细胞株。他们的方法是:从受精后59周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordial germ cell)。由此培养的细胞株,证实具有全能干细胞的特征。你现在浏览的是第十九页,共73页20你现在浏览的是第二十页,共73页21 Induced differentiation of human ES-derived cells in culture.你现在浏览的是第二十一页,共73页22ES细胞的体外培养细胞的体外培养(取自干细胞和发育生物学,叶鑫生等编,2000.4)你现在浏览的是第二十二页,共73页23Pluripotent murine embryonic germ cells iden
12、tified by red staining你现在浏览的是第二十三页,共73页24A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell你现在浏览的是第二十四页,共73页25A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells.Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of st
13、em cells.你现在浏览的是第二十五页,共73页261.ES细胞的全能性主要体现在以下几方面:细胞的全能性主要体现在以下几方面:形成畸胎瘤。将形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤,包括三个胚层细胞;细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤,包括三个胚层细胞;形成类胚体。培养形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长,或控制增殖细胞数目。细胞在非粘附底物中悬浮生长,或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体,它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有能够使之生成类胚体,它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织;三个胚层组织;直系分化。通过控制直系分化。通过控制ES
14、细胞生长环境,或遗传操纵特定基因表达,细胞生长环境,或遗传操纵特定基因表达,ES细胞可直接细胞可直接分化成某特定种系细胞,例如将神经决定基因分化成某特定种系细胞,例如将神经决定基因NeuroD2和和NeuroD3转人转人ES细胞,可使细胞,可使之分化为神经细胞;之分化为神经细胞;形成嵌合体。将形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后,可以形成嵌合体细胞注射到同种动物囊胚腔中后,可以形成嵌合体(chimera),),ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为细胞系是否为ES细胞的标准。细胞的标准。你现在浏
15、览的是第二十六页,共73页272.ES2.ES细胞生物学特性细胞生物学特性细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达你现在浏览的是第二十七页,共73页28 ESES细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型 1.1.各种动物的各种动物的ESES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构,胞体体积小,核大,有一个或几个核仁。构,胞体体积小,核大,有一个或几个核仁。2.ES2.ES细胞与卵圆柱期(细胞与卵圆柱期(egg cylinder stageeg
16、g cylinder stage)胚胎外胚层)胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似,而与和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似,而与 ICMICM细胞有差异。细胞有差异。3.3.细胞中多为常染色质,胞质结构简单,散布着大量核糖体和线细胞中多为常染色质,胞质结构简单,散布着大量核糖体和线粒体,核型正常,保留了整倍体性质。正常粒体,核型正常,保留了整倍体性质。正常ESES细胞染色体正常,细胞染色体正常,如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。4.ES4.ES细胞在体外分化抑制培养中,呈克隆状生长,细胞细胞在体外分化抑制培养中,呈克隆状生长,细胞紧密地聚集在一起,
17、形似鸟巢,细胞界限不清,克隆周围有紧密地聚集在一起,形似鸟巢,细胞界限不清,克隆周围有时可见单个时可见单个ESES细胞和分化的扁平状上皮细胞。细胞和分化的扁平状上皮细胞。5.ES5.ES细胞增殖迅速,每细胞增殖迅速,每181824 h24 h分裂增殖分裂增殖 1 1次。次。6.6.此外,其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的此外,其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性,并且来细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性,并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。自一个克隆的细胞具有同样的特征。你现在浏览的是第二十八页,共73页29 ESES细
18、胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能 ESES细胞的全能性是其区别于成细胞的全能性是其区别于成 纤维细胞等体细胞的显著特点纤维细胞等体细胞的显著特点1.ES1.ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态,一旦脱离饲养层就自发地进行分化。化状态,一旦脱离饲养层就自发地进行分化。2.2.在单层培养时细胞自发分化成多种细胞,在单层培养时细胞自发分化成多种细胞,悬浮培养中:悬浮培养中:“简单类胚体简单类胚体”“囊状胚体囊状胚体”细胞分化物。细胞分化物。3.ES3.ES细胞可进行诱导分化细胞可进行诱导分化 *用用RARA(维生素(维生素A A酸或视
19、黄酸)作诱导酸或视黄酸)作诱导9090以上的以上的ESES细胞细胞 分化为神经胶质细胞,分化为神经胶质细胞,*聚集培养的聚集培养的ESES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。的心肌细胞。*将将ESES细胞注射到同源动物皮下,可形成组织瘤,其细胞细胞注射到同源动物皮下,可形成组织瘤,其细胞 组成可代表组成可代表3 3个胚层细胞。个胚层细胞。*用用ESES细胞作核供体进行细胞核移植,可以得到可发育重细胞作核供体进行细胞核移植,可以得到可发育重 构胚和动物个体。构胚和动物个体。你现在浏览的是第二十九页,共73页30 碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达 许多
20、资料表明,小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细许多资料表明,小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶(胞均有碱性磷酸酶(AKPAKP)表达,小鼠的)表达,小鼠的ECEC细胞和细胞和ESES细细胞中均含有丰富的胞中均含有丰富的AKPAKP。而在已分化的。而在已分化的ECEC细胞和细胞和ESES细胞中细胞中AKPAKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹桑椹胚和早期囊胚胚和早期囊胚AKPAKP呈阳性。因此,呈阳性。因此,AKPAKP常用来作为鉴定常用来作为鉴定ECEC细胞或细胞或ESES细胞细胞分化与否的标志之一。分化与否的标志之一。你现在浏览的是第三十页,共73页31胚胎阶段特异
21、性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(SSEASSEA1 1)。)。在胚胎的原始外胚层细胞、在胚胎的原始外胚层细胞、ESES细胞、细胞、ECEC细胞和原始生殖细胞的表细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到面均可检测到SSEASSEA1 1的表达。小鼠的表达。小鼠SSEASSEA1 1的表达自的表达自8 8一细胞期开一细胞期开始,直到原始外胚层形成期。早期囊胚始,直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICMICM细胞全部呈强阳性,晚细胞全部呈强阳性,晚期囊胚中部分期囊胚中部分ICMICM呈强阳性,部分
22、呈弱阳性,少部分为阴性。因呈强阳性,部分呈弱阳性,少部分为阴性。因此,此,SSEASSEA也常作为也常作为ESES细胞鉴定的一个标志。细胞鉴定的一个标志。你现在浏览的是第三十一页,共73页323.ES3.ES细胞的鉴定细胞的鉴定-细胞的形态结构细胞的形态结构-核型分析核型分析-碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(AKPAKP)染色)染色-SSEA-I-SSEA-I 免疫荧光标记免疫荧光标记-分化能力检测分化能力检测 体外分化试验体外分化试验 体内分化试验体内分化试验 嵌合体形成试验嵌合体形成试验 核移植试验核移植试验你现在浏览的是第三十二页,共73页33 ESES细胞形态学鉴定细胞形态学鉴定 依依ESES
23、细胞的形态结构(胞体体积细胞的形态结构(胞体体积小,核大、有一个或几个核仁)和生长小,核大、有一个或几个核仁)和生长特性(呈克隆状生长,细胞紧密聚集,特性(呈克隆状生长,细胞紧密聚集,形似鸟巢,界限不清)对形似鸟巢,界限不清)对ESES细胞进行初细胞进行初步鉴定。步鉴定。你现在浏览的是第三十三页,共73页34核型分析核型分析 ESES细胞具有正常二倍体核型,细胞具有正常二倍体核型,可用核型分析进行检验可用核型分析进行检验你现在浏览的是第三十四页,共73页35 碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(AKPAKP)染色)染色 *常用快绿(常用快绿(Fast Green Staining)Fast Green S
24、taining)染色法,染色法,*对照以已建系对照以已建系ESES细胞(或小鼠的脱带桑椹胚细胞(或小鼠的脱带桑椹胚 或囊胚)作为阳性对照,或囊胚)作为阳性对照,*作用液中不含作用液中不含-萘酚磷酸钠为阴性对照。萘酚磷酸钠为阴性对照。*结果判定阳性对照结果判定阳性对照ESES细胞染成棕色,阴性对细胞染成棕色,阴性对 照无色。小鼠照无色。小鼠3 35 5日龄胚胎日龄胚胎ICMICM为强阳性为强阳性。你现在浏览的是第三十五页,共73页36 SSEA-I SSEA-I 免疫荧光标记免疫荧光标记 第第1 1抗体,抗体,SSEASSEA1 1(鼠抗(鼠抗ESES细胞单克隆抗体),细胞单克隆抗体),1:10
25、01:100稀释;第稀释;第2 2抗体,羊抗鼠抗体,羊抗鼠 1 1:1010稀释稀释;封闭液,羊抗兔封闭液,羊抗兔lgGlgG。步骤步骤杜氏杜氏PBSPBS洗洗3 3次次,2,2TritonTriton作用作用20 min20 min;再以杜氏再以杜氏PBSPBS洗洗3 3次次,封闭液中置封闭液中置20min20min;以杜氏以杜氏PBSPBS洗洗3 3次,加第次,加第1 1抗体于抗体于44过液;过液;以杜氏以杜氏PBSPBS洗洗3 3次,加第次,加第2 2抗体于抗体于3030温箱置温箱置30min30min;再以杜氏再以杜氏PBSPBS洗洗3 3次后用甘油次后用甘油PBSPBS封片。封片。样
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