张嗣同发酵工程典型发酵过程的特性与工业控制.pptx

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1、一、动物细胞培养的特性一、动物细胞培养的特性动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。第1页/共46页第2页/共46页两个专业术语细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。第3页/共46页细胞生长的类型贴壁依赖性来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋

2、巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。第4页/共46页第5页/共46页第6页/共46页第7页/共46页二、细胞培养物的获得二、细胞培养物的获得原代培养物在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某些细胞类型的生长。第8页/共46页第9页/共46页转化细胞正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二

3、倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：有些细胞在培养中自发转化化学转化。某些化学致癌物会增加转化频率病毒转化。致瘤因子转化第10页/共46页转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物制品，如重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人们对她们的安全性仍然非常关心，对可能造成的生物危害性进行严格的检测和控制。第11页/共46页肿瘤细胞肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。肿瘤

4、细胞有很好的增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。第12页/共46页体外培养所需的一般条件适宜的培养皿 血清成分 370C CO2595100湿度 抗生素第13页/共46页第14页/共46页温度 低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。黏度 培养基的黏度主要受血清含量的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损伤小。加入羧甲基纤维素或聚

5、己烯基吡咯烷增加培养基黏度第15页/共46页细胞培养基的基本组成1、水细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应高于注射用水标准。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。第16页/共46页3、氮源氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成复杂含氮化合物的前体，还作为必

6、不可少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。第17页/共46页4、维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。5、无机离子无机离子分为两组，一种是含量较高的，包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压平衡（Na+，Cl），作为酶的辅因子（Mg2+），

7、促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。第18页/共46页6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清，在无血清培养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。非营养性物质1、抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与510CO2平衡，否则培养基迅速变碱。HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。第1

8、9页/共46页3、酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂4、保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、Pluronic F68、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。5、还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸利用。第20页/共46页血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质

9、、采血中引入的污染物。由于历史原因，商业培养基大都是按添加血清来设计的，使用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。第21页/共46页第22页/共46页第23页/共46页第24页/共46页第25页/共46页五、动物细胞的大规模培养五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境（一）培养环境1、温度 温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是25280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。第26页/共46

10、页2、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类（2）对流空间大小（3）葡萄糖浓度培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。第27页/共46页也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其缓冲能力为pH6.87.2。但是当HEPES浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害作用。动物

11、细胞大规模培养时常有几种方法来调节培养液中的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节第28页/共46页（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培养时不太合适。通常通过调节培养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来控制发酵过程的pH。第29页/共46页3、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得目的有两个：一是提供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发酵液处于均匀悬浮状态，有利于

12、传质过程。第30页/共46页（三）培养容器（三）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易放入培养箱内培养。2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十立方米。第31页/共46页微载体微载体是指直径在60250m、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好处;可在反应器中提供大的比表面积可采

13、用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况容易放大适合于多种贴壁依赖性细胞培养容易收获细胞。微载体培养系统的缺点是：细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长微载体价格较贵，一般不能重复使用需要较高的细胞接种量。第32页/共46页悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设计和操作上又有特殊要求如利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并通过

14、表面充气及诱导表面气泡产生具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传递速率第33页/共46页第34页/共46页细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器与其它反应器相比，结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细胞机械损伤第35页/共46页通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混合性能好，产生的剪切力小，气泡产生的不利影响小。设计有多种形式

15、的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。笼式搅拌器有两个由200目不锈钢丝网围成的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在反应器中积累。第36页/共46页搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混

16、合。在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转速在3060r/min范围内，混合时间为1224s。第37页/共46页第38页/共46页第39页/共46页细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氢钠缓冲液系统来控制培养液的pH值，它主要是靠预先加入培养基液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量中的二氧化碳含量来实现。第40页/共46页生物反应器中的细胞培养模式分批培养分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也不断形成，

17、经过一定时间反应后，将整个反应系取出。流加培养流加培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系。第41页/共46页半连续培养半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。连续培养连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出

18、，反应条件处于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。第42页/共46页灌注培养灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中细胞密度为（2！4）106cell/ml，在灌注系统中可达到（25）107cell/ml。第43页/

19、共46页培养基研究进展无血清培养基 通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。第44页/共46页其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。第45页/共46页感谢您的观看。第46页/共46页