蛋白酶活力的测定.pdf

《蛋白酶活力的测定.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白酶活力的测定.pdf（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、实验三实验三蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定一、目的一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。二、原理二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。三、试剂及仪器试剂及仪器1 福林酚试剂称取 50g 钨酸钠(Na2WO42H2O)，12.5g 钼酸钠(Na2MoO42H2O)，置入 1000mL 原底烧瓶中，加 350mL 水，25mL85%磷酸，50mL 浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加 50g 硫酸锂(Li2SO4)和 25mL 水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却

2、，用 4 号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。使用时用 2 倍体积的水稀释。2 0.4mol/L 碳酸钠溶液：称取 42.4g 碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。3 0.4mol/L 三氯乙酸溶液：称取 65.5g 三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。4 2%酪蛋白溶液称取 2.00g 酪蛋白(又名干酪素)，加约 40mL 水和 23 滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用 pH7.2 磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。5 pH7.2 磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取 31.2g 磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)，用水溶解稀释至1000

3、mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取 71.6g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2 磷酸缓冲溶液：取 28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和 72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至 1000mL。6标准酪氨酸溶液：准确称取 0.1g DL-酪氨酸，加少量 0.2mol/L 盐酸溶液(取 1.7mL 浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含 DL-酪氨酸 100 微克。7仪器：分光光度计、试管四、操作步骤操作步骤1 标准曲线绘制取 9 支试管，按下表将标准酪氨酸溶液稀释。编号标准酪氨酸溶液(

4、mL)100g/mL水(mL)稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL)在上述各管中各取 1mL，分别加入 5mL 0.4mol/L 碳酸钠溶液，1mL 福林酚试剂，于40 C 水浴显色 20min，在680nm 波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为 1 时相当的酪氨酸g 数，即为 K 值。00010011910228203373044640555506646077370882802酶液的制备0准确称取酶粉 0.5g，用 pH7.2 磷酸缓冲溶液定容至 100mL，置入 40 C 水浴浸取 0.5h，用纱布过滤。根据酶活力的高低，再用pH7.2 磷酸缓冲溶液稀释一定倍数(使其测定的吸光度

5、在 0.20.4 范围内为宜，约 4-5 倍)。3 测定00取一支离心管，加入 1mL 稀释酶液，置入 40 C 水浴中预热 35min，再加入预热至 40 C 的2%酪蛋白溶液 1mL，准确及时保温 10min。立即加入 2mL0.4mol/L 三氯乙酸溶液，15min 后离心分离或用滤纸过滤。吸取 1mL 清液，加 5mL0.4mol/L 碳酸钠溶液，最后加入 1mL 福林0酚试剂，摇匀，于 40 C 水浴中显色 20min。另取一支离心管为空白管。在空白管中先加入 1mL 稀释酶液，再加入 2mL0.4mol/L 三氯乙酸溶液，再加 1mL2%酪蛋白溶液，15min 后离心分离或用滤纸过

6、滤。吸取 1mL 清液，加05mL 0.4mol/L 碳酸钠溶液，最后加入1mL 福林酚试剂，摇匀，于40 C 水浴中显色 20min。以空白为对照，在 680nm 波长下测吸光度。4.计算0蛋白酶活力单位的定义：1g 酶粉，在 40 C，pH7.2 下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克(g)数。蛋白酶活力=K E41N 10W式中：E试管的吸光度 4离心管中反应液的总体积，mL 10反应 10min N稀释倍数 W酶粉称取量，g K 为 Y=1 时 X 的值 即 1.14结果与分析：结果与分析：OD680CK 1 2 30 3.85 2.05 3.71表面上看 2 号样的数据看似很有可以于是从

7、上面的表格分析，平均的习惯值为3.852.053.713.20样品标准误差为33.85-3.2022.05-3.2023.71-3.2023-11.001 1s来判断样品 2 数据是否舍去。根据格拉布斯法则xp x（，n）Xp=质疑的数据x=平均值为置信水平N 为样品数S 为样品标准误差2.053.20 1.15(0.05,3)s 1.1531.00 1.153 1.15所以样品2的数据属于正常范围内。即在处理数据的时候不应该将样品2 忽略舍去。于是样品的酶的活力。41200702.24100.541样品 2 酶活力为1.142.05200373.92100.541样品 3 酶活力为1.143.71200676.704100.5702.24373.92676.704平均酶活力为：584.2883样品 1 酶活力为1.143.85从上述的实验，样品 2 的波动的原因可以归结为一、有可能是在酶液移液的时候有过多的损失而造成了酶活力很少的偏差二、有可能是在处理酶液的时候由于条件的不适而造成酶活力的降低，有可能实验时候温度的波动 三、有可能是分光光度计的操作的失误。参考文献：1实验设计与数据处理 李云雁 胡传荣 化学工业出版社 12 页（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）