蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢.pptx
《蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢.pptx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢.pptx(48页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、蛋白质合成细胞工厂蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢与微生物代谢研究组研究组张大伟中国科学院天津工业生物技术研究所2016-71 1研究组团队建设研究组团队建设2 2蛋白表达系统、酶制剂、医药蛋白蛋白表达系统、酶制剂、医药蛋白3 3维生素与氨基酸维生素与氨基酸4 4总结与展望总结与展望汇报内容汇报内容一一.研究组团队建设研究组团队建设蛋白质合成细胞工厂与微生物代谢研究组Protein production cell factory and microbial metabolism LaboratoryProtein production cell factory and microbial met
2、abolism Laboratory以合成生物技术设计和创造微生物细胞工厂以系统生物技术解析并提升工业微生物生产能力张大伟,博士,研究员博生导师2007年获得北京化工大学博士学位2007-2012美国威斯康星大学密尔沃基分校,博士后2008-2012美国加州理工学院,博士后2012-今,中科院天津工生所,研究员,博士生导师核心技核心技术“菌株菌株创建建与改造升与改造升级”研究组成员介绍研究组成员介绍研究组人员共研究组人员共26人人u工作人员8人u在读博士3人u在读硕士15人u已经毕业硕士9人付 刚:蛋白表达系统盖园明:酶与表达系统李心利:蛋白分泌机制夏苗苗:遗传与代谢董会娜:遗传与组学刘永飞:
3、代谢与组学宋国田:代谢与发酵二、蛋白质合成细胞工厂、二、蛋白质合成细胞工厂、酶制剂、医药蛋白酶制剂、医药蛋白蛋白表达系统蛋白表达系统平台平台建立建立u大肠杆菌表达系统u枯草芽孢杆菌表达系统u酵母表达系统Song,Zhang*,JMB2015除了拥有成熟的枯草芽孢杆菌表达系统,我们也在建立并完善大肠杆菌表达除了拥有成熟的枯草芽孢杆菌表达系统,我们也在建立并完善大肠杆菌表达系统和酵母表达系统,我们要建立能够表达蛋白,酶的综合平台。系统和酵母表达系统,我们要建立能够表达蛋白,酶的综合平台。耐高温-淀粉酶最适pH在5-7,最适温度为90-95,在喷射液化工艺中瞬间温度达105-110,仍能有效水解淀粉
4、,具有极好的耐热性,广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上,市场需求量极大目前高温淀粉酶生产主要依赖芽孢杆菌,仍存在异源表达效率低下、缺乏有效的表达系统等不足,生产成本居高不下,无法充分占领潜在市场通过对枯草芽孢杆菌进行变的表达载体、表达宿主以及淀粉酶基因的综合优化,从而提高目前高温淀粉酶的适应性和表达水平高温淀粉酶生产主要被诺维信、杰能科公司垄断,且国内生产厂商存在专利风险实例一、高温淀粉酶的表达优化高温酸性淀粉酶广泛应用于纺织退浆、酒精、啤酒、味精、酿造等领域实例一、高温淀粉酶的表达优化基因改造基因改造DS4.0同源建模分析确定突变位点耐酸耐热突变体筛选表达元件表达元件优
5、优化化菌种改造菌种改造强启动子优化信号肽文库筛选转运蛋白过表达筛选蛋白酶敲除分析高通量诱变筛选A.M4突变体耐热温 度 提 高 至100B.100处理半小时后酶活仍保留70%C.M4突变体最适pH值降低至6ABC实例一、高温淀粉酶的表达优化基因改造基因改造DS软件分析确定突变位点耐酸耐热突变体筛选表达元件表达元件优优化化菌种改造菌种改造强启动子优化信号肽文库筛选转运蛋白过表达筛选蛋白酶敲除分析高通量诱变筛选替换P103强启动子后表达量提高2倍信号肽替换为SP7后提高1.7倍酶活达到1500U/mL实例一、高温淀粉酶的表达优化基因改造基因改造DS软件分析确定突变位点耐酸耐热突变体筛选表达元件表达
6、元件优优化化菌种改造菌种改造强启动子优化信号肽文库筛选转运蛋白过表达筛选蛋白酶敲除分析高通量诱变筛选ABCA.G23过表达提高6倍,组合过表达再提高1.5-1.7倍B.胞外蛋白酶敲除后表达量提高,但杂蛋白也增多C.5L发酵罐发酵后酶活达到2500-5000U/mL实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂,能催化蛋白质和多肽水解,在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。目前中性蛋白酶及碱性蛋白酶的生产主要来源于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。两株野生芽孢杆菌存在限制修饰系统(RM system),无法利用目前常规的两步法及电转化法进行遗传转化,因此首先要建立遗传
7、转化方法通过培养基优化、迭代驯化、高通量诱变筛选等手段优化蛋白酶表达同时建立野生芽孢杆菌的遗传转化技术2株蛋白酶菌株分别为解淀粉芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌,分别命名为TIB-139与TIB-239。在此基础上进行发酵优化及酶活测定通过对土壤中的菌种进行芽孢筛选+牛奶平板筛选,获得了2株明显分泌蛋白酶的芽孢杆菌菌株实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化培养基培养基优优化化遗传转遗传转化方化方法建立法建立高通量高通量诱变诱变筛选筛选体系体系通过优化培养基组分,摇瓶发酵酶活水平分别达到2500U/mL及8000U/mL,比出发菌株分别提高2-4倍实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化培养基培养基优优化化遗传转遗传转
8、化方化方法建立法建立高通量高通量诱变诱变筛选筛选体系体系对2株蛋白酶菌株完成了全基因组测序分析工作实例二、蛋白酶表达菌株的分离优化培养基培养基优优化化遗传转遗传转化方化方法建立法建立高通量高通量诱变诱变筛选筛选体系体系利用上述HTS体系结合诱变手段筛选获得的突变体经摇瓶发酵后,蛋白酶酶活分别达到5,000U/mL及10,000U/mL实例三、异构酶DPE的分泌表达优化DPE异构酶可催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的相互转化,在阿洛酮糖生物转化过程中是重要的催化剂。D-阿洛酮糖作为一种重要的稀少糖,其安全性及其在食品中的应用已被日本厚生省批准,可以作为保健品进行开发。利用建立的表达元件文库及菌株文
9、库,针对DPE进行特异性优化,组合优势性状,构建枯草芽孢杆菌DPE高产分泌工程菌解决DPE异构酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达问题,同时利用文库筛选平台对表达效率进行优化,构建初代DPE工程菌株针对大肠杆菌表达存在的不易提取纯化、存在安全性隐患等问题,我们尝试利用枯草芽孢杆菌进行分泌表达孙老师课题组成功分离了来自瘤胃菌的DPE酶实例三、异构酶DPE的分泌表达优化通过平台建立的信号肽文库,针对DPE酶进行分泌表达尝试,并筛选分泌效率更高的信号肽序列作为表达元件。结合强启动子及菌株文库筛选,获得能够高效分泌DPE的枯草芽孢杆菌菌株。发酵罐发酵48hr后表达量2g/L,达到产业化水平。MediaCell
10、实例四、甘露聚糖酶的分泌表达通过平台建立的信号肽文库,针对甘露聚糖酶进行分泌表达尝试,并筛选分泌效率更高的信号肽序列作为表达元件。结合强启动子及菌株文库筛选,获得能够高效分泌甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株。发酵罐发酵48hr后表达量约为2g/L,达到行业领先水平实例五、大肠杆菌分泌表达FGF21FGF21(成纤维细胞生长因子)是具有降低血糖,治疗糖尿病和肥胖症的新兴医药蛋白,我们在大肠杆菌中实现了可溶性分泌表达,并继续优化分泌表达量。首次实现FGF21蛋白在大肠杆菌中的原型分泌表达,无需传统包涵体-复性纯化手段,极大简化了后续纯化工艺pET-11d-SPpelB-FGF21/Chaperone
11、DsbA/DsbB/DsbC/DsbD/PpiD/PpiA/IbpABCulture condition:30ml/250mlflaskTBmedium(0.5mg/mlL-arabinose)OD6002add0.3mMIPTGCultivatetime:24h与与诺和和诺德德签署署120万万合作合作协议三、微生物代谢维生素B12、氨基酸维生素B12组学分析与代谢工程改造2023/2/23维生素B12研究背景VB12晶体结构发展状况:国外:1955美国 222.5Kg1968 美国 1153Kg20世纪90年代 罗氏 2400Kg目前 Avensis 7000Kg国内:华北制药、石药集团 1
12、0000Kg应用:(1)医疗方面:治疗贫血、神经疼等;(2)饲料方面:添加剂、提高蛋白饲用率等;(3)其它方面:食品添加剂、化妆品等。国内VB12需求量趋势VB12结构式待解决问题 维生素B12又叫钴胺素,人体生长中具有重要的生理作用,既能够促进红细胞的发育和成熟又能作为辅酶促进叶酸在体内的代谢。虽虽然然VBVB1212市市场场需需求求不不断断增增加加,但但微微生生物物合合成成VB12VB12的的产产量量较较低低,因因为为VB12VB12合合成成路路线线比比较较长长,调调控控复复杂杂,遗遗传传方方法缺乏,限制了产量进一步的提高。法缺乏,限制了产量进一步的提高。VB12菌株改造策略基因组分析与组
13、学挖掘通过全基因组测序,解析VB12功能途径基因,通过比较组学,挖掘关键位点代谢途径改造解除酶的反馈抑制;敲除代谢途径中支路途径,增强主路途经;过表达代谢途径限速蛋白。诱变筛选建立VB12高产菌株高通量筛选方法,对SM菌进行诱变,再通过高通量筛选方法筛得VB12高产菌株优化发酵工艺优化发酵培养基的组份和发酵的PH、温度及溶氧等 VB12生生产菌株改造主要包括理性菌株改造主要包括理性设计和和诱变高通量高通量筛选方法同方法同时进行行 利用代利用代谢工程,合成生物学,工程,合成生物学,组学,高通量学,高通量筛选等技等技术达到提高达到提高VB12最最终产量的目的。量的目的。VB12菌株性质及遗传方法建
14、立MSHPLC发酵结果对比菌落形态100*代谢途径改造目前目前维生素生素B12生生产菌株菌株呈呈长杆状,杆状,发酵周期酵周期较长,产量量较低,低,遗传操作困操作困难。我我们对VB12菌菌株株进行行了了鉴定定,建建立立了了遗传操操作作方方法法,可可以以有有效效对目的基因目的基因进行敲除和行敲除和过表达等操作,表达等操作,为菌株改造提供了有力工具。菌株改造提供了有力工具。遗传方法建立VB12菌株全基因组测序与功能途径分析基因基因组信息信息对研究合成途径十分重要,是菌株改造的核心基研究合成途径十分重要,是菌株改造的核心基础信息。信息。对VB12菌株菌株进行了全基因行了全基因组分析,序列拼接和基因注解
15、。分析,序列拼接和基因注解。通通过对VB12菌菌株株全全基基因因组测序序分分析析,发现该菌菌株株中中VB12合合成成途途径径由由5个基因簇个基因簇调控控组成。从成。从ALA合成合成VB12,需要,需要21步,步,25个基因。个基因。VB12菌株的代谢途径改造 对构建的一系列工程菌株进行摇瓶优化和评价,筛选到了新一代菌株。通通过理性理性设计,针对潜在的靶点潜在的靶点进行行过表达,解除表达,解除riboswich,增加合,增加合成途径通量,消弱成途径通量,消弱竞争途径。争途径。12345通通过理性理性设计,针对潜在的靶点潜在的靶点进行改造,解除行改造,解除riboswich,增加合成,增加合成途径
16、通量,消弱途径通量,消弱竞争途径。争途径。获得新一代生得新一代生产菌株。菌株。代谢工程改造的菌株产量提高50%具有产业化前景!微生物发酵微生物发酵生产维生素生产维生素B12B12苏氨酸菌株蛋白组学解析及生理功能鉴定蛋白组学解析苏氨酸菌株高产机制菌株高产抗逆机理的解析对理解和改造菌株十分重要,蛋白质组学作为一个优势的菌株高产抗逆机理的解析对理解和改造菌株十分重要,蛋白质组学作为一个优势的技术,能够很好的解析高产菌株的机理和菌株发酵过程蛋白组学技术,能够很好的解析高产菌株的机理和菌株发酵过程蛋白组学通过iTRAQ技术,对苏氨酸发酵过程进行过程蛋白组学分析,利用无标记蛋白组学技术对高产菌株的蛋白进行
17、相对定量,找出多个靶点和进一步改造菌种策略高通量快速检测苏氨酸的方法苏氨酸的快速检测对高通量筛选苏氨酸高产菌株具有重要意义苏氨酸的快速检测对高通量筛选苏氨酸高产菌株具有重要意义因此开发快速检测苏氨酸含量的方法十分重要因此开发快速检测苏氨酸含量的方法十分重要苏氨酸可以被苏氨酸醛缩酶催化成乙醛,乙醛可以在NADH参与下被氧化。因此建立了苏氨酸与OD430的线性关系。该方法在SM,LB,发酵培养基,及96空板中都有较好的应用,是一个较为有效的快速检测苏氨酸的方法。为高通量筛选提供有力工具。苏氨酸新转运蛋白的挖掘与鉴定增强苏氨酸的转运外排,对提高菌株生产能力,解除氨基酸对胞内的抑制和压力,具有重要的增
18、强苏氨酸的转运外排,对提高菌株生产能力,解除氨基酸对胞内的抑制和压力,具有重要的意义。挖掘和鉴定苏氨酸新的转运蛋白,对苏氨酸增加外排的改造策略,提高苏氨酸产量,具意义。挖掘和鉴定苏氨酸新的转运蛋白,对苏氨酸增加外排的改造策略,提高苏氨酸产量,具有重要的理论和实践意义。有重要的理论和实践意义。我们利用蛋白组学的方法,挖掘了潜在的外排苏氨酸的蛋白,对该蛋白做了遗传学,生理学鉴定,发现蛋白Yecc-Yecs参与了苏氨酸的外排。苯丙氨酸菌株组学解析与工程菌株构建评价苯丙氨酸工程菌株改造苯丙氨酸是氨基酸类抗癌药的中间体;苯丙氨酸是新型甜味剂阿斯巴甜重要原料;苯丙氨酸是养殖业饲料中的必须添加组分之一(谷物
19、中苯丙氨酸含量较低)。苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一,广泛应用于医药苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一,广泛应用于医药、化妆品、食品、化妆品、食品和饲料等和饲料等行业。氨基酸又行业。氨基酸又是多种生物复合物的前体物,具有广泛的用途,利用微生物生产苯丙氨酸具有重要意义。是多种生物复合物的前体物,具有广泛的用途,利用微生物生产苯丙氨酸具有重要意义。传统的菌株改造方法中,对菌株的高产机理的认识模糊,缺乏理性改造及高效的快速筛选方法是限制苯丙氨酸产量进一步提高的瓶颈。全球每年氨基酸的需求量为450万吨,其中苯丙氨酸每年超过30000吨,并且以每年10%的速率增长;目前文献报道最高水平为55g/L,具有巨大
20、的潜在提升空间。传统的诱变筛选方法耗时久,收效低,不能够满足现在竞争激烈的行业要求。苯丙氨酸工程菌株改造策略本课题组以理性和非理性改造相结合的方法进一步提高苯丙氨酸的产量,同时利用本课题组以理性和非理性改造相结合的方法进一步提高苯丙氨酸的产量,同时利用组学手段解析苯丙氨酸高产菌住的胞内调控机制,解析高产的机理,提高产量。组学手段解析苯丙氨酸高产菌住的胞内调控机制,解析高产的机理,提高产量。苯丙氨酸菌株基因组测序分析对诱变筛选到的高产菌株进行基因组测序,对重要代谢途径中关键酶进行分析对诱变筛选到的高产菌株进行基因组测序,对重要代谢途径中关键酶进行分析关关键基因的点突基因的点突变及及结构构变异异对
21、于于菌株解除反菌株解除反馈抑制、抑制、增加前体和能增加前体和能量量供供给等等都有重要作用。都有重要作用。苯丙氨酸高产菌株高产机理分析高高产菌株的明菌株的明显上上调phe合成途径合成途径,和和高高产菌株的相关的菌株的相关的调控因子的基因控因子的基因变化化密切相关密切相关,从而,从而验证了高了高产机制,并且找到了代机制,并且找到了代谢瓶瓶颈。为了解析菌株了解析菌株的高的高产机理,分析机理,分析了苯丙氨酸高了苯丙氨酸高产菌株和野生型菌株菌株和野生型菌株 的的中央代中央代谢途径及苯丙氨酸合成途径途径及苯丙氨酸合成途径蛋白蛋白组变化情况。化情况。高通量筛选系统原理示意图高通量筛选系统原理示意图转录调控因
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 合成 细胞 工厂 微生物 代谢
限制150内