植物细胞的获取.pptx

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1、第一节外植体的选择与预处理第一节外植体的选择与预处理成功关键：成功关键：培养基及培养条件、外植体的来源培养基及培养条件、外植体的来源培养基及培养条件、外植体的来源培养基及培养条件、外植体的来源。一、外植体的选择一、外植体的选择一、外植体的选择一、外植体的选择从生长正常，无病虫害的母株中，选择适宜的组织器官从生长正常，无病虫害的母株中，选择适宜的组织器官 1 1、用于直接分离细胞的外植体的选择、用于直接分离细胞的外植体的选择、用于直接分离细胞的外植体的选择、用于直接分离细胞的外植体的选择原则：细胞之间粘连程度较小；原则：细胞之间粘连程度较小；叶片最佳；叶片最佳；限制：机械或酶伤害细胞，完整细胞较

2、少。限制：机械或酶伤害细胞，完整细胞较少。第1页/共51页2 2、用于愈伤组织诱导的外植体的、用于愈伤组织诱导的外植体的选择选择双子叶植物中常用的外植体有：双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。单子叶植物中常用的外植体有：单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、细穗、花药等。幼胚、成熟胚、细穗、花药等。幼胚、成熟胚、细穗、花药等。幼胚、成熟胚、细穗、花药等。无无论论是是双双子子叶叶植植物物还还是是单单子子叶叶植植物物、均均以以幼幼幼幼胚胚胚胚诱

3、诱导导愈愈伤伤组组织织的的为为最最佳佳。因因为为幼幼胚胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。基因型的影响：不同种类及不同品种之间存在差异；基因型的影响：不同种类及不同品种之间存在差异；第2页/共51页同一植物，不同部同一植物，不同部位脱分化和再分化位脱分化和再分化能力存在差异：百能力存在差异：百合：外层内层；合：外层内层；紫草根茎叶；苹紫草根茎叶；苹果顶芽褐变程度果顶芽褐变程度侧芽；兰科：茎尖；侧芽；兰科：茎尖；还要考虑生产目的：还要考虑生产目的：选用植株中主要生选用植株中主要生产所需的的次级代产所需的的次级代谢产物的组织和器谢产物的组织和器官官第3页/共5

4、1页2 2、用于愈伤组织诱导的外植体的选择、用于愈伤组织诱导的外植体的选择外植体的生理状态：红豆杉：新生的嫩枝；外植体的生理状态：红豆杉：新生的嫩枝；取材季节：母株生长旺盛的季节；紫草：秋天（紫草宁合成和积累）；取材季节：母株生长旺盛的季节；紫草：秋天（紫草宁合成和积累）；外植体大小：适当大小；脱毒率和茎尖大小及成活率之间的关系；外植体大小：适当大小；脱毒率和茎尖大小及成活率之间的关系；第4页/共51页3 3、用于分离原生质体的外植体的选择、用于分离原生质体的外植体的选择分离原生质体则以叶片为最好。苗龄与叶龄有关；太老不易游离，太嫩，易游离，分离原生质体则以叶片为最好。苗龄与叶龄有关；太老不易

5、游离，太嫩，易游离，但细胞膜易损害；但细胞膜易损害；以苗龄以苗龄151525d25d，刚展开的幼叶为最佳。，刚展开的幼叶为最佳。无菌苗幼叶；无菌苗幼叶；还要考虑培养目的；还要考虑培养目的；多数情况下，需要根据实验确定；多数情况下，需要根据实验确定；第5页/共51页4 4、花粉材料的选择、花粉材料的选择用作花粉培养的亲本植株的用作花粉培养的亲本植株的基因型基因型基因型基因型、生长情况生长情况生长情况生长情况以以及接种时花粉所处的及接种时花粉所处的发育时期发育时期发育时期发育时期，对花粉植株的诱，对花粉植株的诱导频率都有直接的影响。导频率都有直接的影响。关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才关

6、键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为为单核期，或单核中晚期单核期，或单核中晚期单核期，或单核中晚期单核期，或单核中晚期。第6页/共51页四分体小孢子单核花粉双四分体小孢子单核花粉双核花粉核花粉花粉的发育时期花粉的发育时期第7页/共51页花药培养属于器花药培养属于器官培养范畴官培养范畴花粉培养也称为小孢子花粉培养也称为小孢子培养。培养。是从花药中分离

7、出花是从花药中分离出花粉粒粉粒,使之成为分散的或游离的使之成为分散的或游离的状态状态,通过培养使花粉粒脱分化通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程进而发育成完整植株的过程.属属于细胞培养的范畴于细胞培养的范畴第8页/共51页1、外植体的灭菌处理、外植体的灭菌处理常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表表二、外植体的预处理二、外植体的预处理第9页/共51页几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消毒剂消毒剂消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度使用浓度使用浓度消毒时间消毒时间消毒时间消毒时间效果效果效果效果残液去除难易残液去除难易残液去除难易残液去除难易次氯酸钙

8、次氯酸钙次氯酸钙次氯酸钙/钠钠钠钠101010105-305-305-305-30好好好好易易易易新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭10101010202020205-305-305-305-30好好好好易易易易氯化汞氯化汞氯化汞氯化汞0.10.10.10.11 1 1 12-102-102-102-10最好最好最好最好 最难最难最难最难过氧化氢过氧化氢过氧化氢过氧化氢10101010121212125-155-155-155-15较好较好较好较好最易最易最易最易抗菌素抗菌素抗菌素抗菌素4 4 4 450mg/L50mg/L50mg/L50mg/L 30-6030-6030-6030-60较好较

9、好较好较好较难较难较难较难第10页/共51页外植体表面灭菌过程：外植体表面灭菌过程：选材选材刷洗、冲洗刷洗、冲洗用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动自自来来水水冲冲净净洗洗衣衣粉粉水水 7070酒酒精精浸浸泡泡10103030秒秒振振荡荡 0.10.1升升汞汞3 31010分分钟钟(表表面面活活性性剂剂)无无菌水冲先菌水冲先3 35 5次次 接种接种第11页/共51页2 2、外植体的其他处理、外植体的其他处理目的：目的：提高愈伤组织诱导率；促进原生质体游离。提高愈伤组织诱导率；促进原生质体游离。方法：方法：预培养；预培养；暗处理；暗处理；低温或高温处理；低温或高温处理；萎蔫

10、处理；萎蔫处理；抗氧化剂处理；抗氧化剂处理；高渗透压预处理；高渗透压预处理；第12页/共51页花药和花粉培养的预处理：花药和花粉培养的预处理：最常用的方法是最常用的方法是低温冷藏低温冷藏低温冷藏低温冷藏。具体做法是将带有叶。具体做法是将带有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。放在冰箱中冷藏。不同材料对处理温度的高低有不同的要求，一般不同材料对处理温度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的温度。低温处理时耐寒植物比喜温可耐受较低的温度。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，间视使用的温度而定，较低的

11、温度处理时间要短，反之则长。烟草反之则长。烟草7 79 9度下处理度下处理7 71414天，水稻天，水稻7 71010度下处理度下处理10101515天，大麦天，大麦3 37 7度下处理度下处理7 71414天，都可显著提高花药的出愈率。天，都可显著提高花药的出愈率。第13页/共51页低温处理的作用：低温处理的作用：预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），产生两个相等核，进而形成愈

12、伤组织或胚状体。产生两个相等核，进而形成愈伤组织或胚状体。保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老。织的衰老。激发花粉产生原胚。激发花粉产生原胚。促使细胞同步分裂。促使细胞同步分裂。技术要点第14页/共51页第二节从外植体直接分离植物细第二节从外植体直接分离植物细胞胞一、机械捣碎法一、机械捣碎法将外植体捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。将外植体捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。优点：不用酶，细胞不会受到伤害；没有经过质壁分离，利于生理生化研究。优点：不用酶，细胞不会受到伤害；没有经过质壁分离，利于生理生化研究。缺点：机械作用，细胞结构破坏大，

13、得率低。缺点：机械作用，细胞结构破坏大，得率低。最佳材料：叶片最佳材料：叶片第15页/共51页方法及步骤：方法及步骤：第一种方法：用刀片刮叶片第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心净化细胞。第二种方法：先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心净化细胞。叶片表面灭菌叶片表面灭菌切成小于切成小于1cm2的小块的小块玻璃匀浆管中匀浆玻璃匀浆管中匀浆过滤（孔径分别为：过滤（孔径分别为：61 m和和38 m）低速离心，弃上清低速离心，弃上清悬浮细胞悬浮细胞细胞培养细胞培养第16页/共51页二、酶解法二、酶解法利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞；利用果胶酶、

14、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞；该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。渗透压保护剂是甘露醇。首次成功：烟草叶细胞首次成功：烟草叶细胞步骤：叶片表面灭菌步骤：叶片表面灭菌撕去下表皮撕去下表皮切成切成4cm2小块小块放入放入酶液中酶液中抽真空抽真空摇床上酶解摇床上酶解每每30min更换一次酶液（第更换一次酶液（第一次弃去，第二次主要含海绵细胞，第三、四次主要含栅栏一次弃去，第二次主要含海绵细胞，第三

15、、四次主要含栅栏细胞）细胞）收集细胞，培养基洗二次后培养收集细胞，培养基洗二次后培养第17页/共51页机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离，有利于进行生理和生化研究机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离，有利于进行生理和生化研究 ；容易伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数量极低；细胞易破。容易伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数量极低；细胞易破。酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。第18页/共51页第三节通过愈伤组织诱导获取植物细第三节通过愈伤组织诱导获取植物细胞胞

16、一、获取过程：一、获取过程：（1 1）诱导产生愈伤组织；）诱导产生愈伤组织；（2 2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。愈伤组织的松散性。（3 3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物。具体方法：培养物。具体方法：用镊子或小刀分割得到植物小用镊子或小刀分割得到植物小细胞团；液体培养基中加入小玻璃珠，振荡培养，细胞团；液体培养基中加入小玻璃珠，振荡培养，使其分散，再过滤获得；适量的果胶酶可促使细胞使其分散，再过滤获得；适量的果胶酶可促使细胞分开。分开。在植物的组织培养中，从一块外植体形成

17、典型的愈在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和启动期、分裂期和启动期、分裂期和启动期、分裂期和形成期形成期形成期形成期。第19页/共51页 启动期启动期启动期启动期是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长素是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有：对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有：2,42,4D D、萘、萘乙酸（乙酸（NAANAA）、吲哚乙酸（）、吲哚乙酸（IAAIAA）、吲哚丁酸（）、吲哚丁酸（IBAIBA）等。）等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在通常使用细胞分裂素和生长

18、素比例在1:l1:l或是小于或是小于1 1来诱来诱导植物愈伤组织的形成。导植物愈伤组织的形成。分裂期分裂期分裂期分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期分化期分化期分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、

19、分生细胞、色素能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。细胞、纤维细胞等等。第20页/共51页外植体的细胞经过外植体的细胞经过启动、分裂和分化启动、分裂和分化启动、分裂和分化启动、分裂和分化等一系列变等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（继

20、续生长增殖，必须定期地（2 24 4个星期）将它个星期）将它们分成小块接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组们分成小块接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。即经常地继代培织就可以长期保持旺盛的生长。即经常地继代培养。养。第21页/共51页二、影响愈伤组织诱导的因素二、影响愈伤组织诱导的因素1 1、外植体：细胞越成熟，脱分化越困难。、外植体：细胞越成熟，脱分化越困难。无菌萌发的幼苗。无菌萌发的幼苗。2 2、培养条件：、培养条件：1 1）激素的种类及浓度：）激素的种类及浓度：生长素：生长素：2,42,4D D、IAAIAA、NAANAA；细胞分裂素：细胞分裂素：KTKT、ZTZT、

21、6 6BABA。2 2）培养基的种类）培养基的种类第22页/共51页3 3）光照和温度）光照和温度（21210.30.3）最佳。最佳。4 4）NHNH4 4/NO/NO3 3-5 5）碳源）碳源 良好的愈伤组织的条件：良好的愈伤组织的条件：良好的愈伤组织的条件：良好的愈伤组织的条件：高度的胚性或再分化能力；高度的胚性或再分化能力；容易分散，以便建立优良的悬浮细胞系和分容易分散，以便建立优良的悬浮细胞系和分离原生质体；离原生质体；旺盛的增殖能力，以便建立大规模的无性系；旺盛的增殖能力，以便建立大规模的无性系；继代不丧失胚性继代不丧失胚性黑暗培养下烟黑暗培养下烟草的愈伤组织草的愈伤组织第23页/共

22、51页继代培养常见问题继代培养常见问题 1.1.变异问题变异问题 影响变异的因素：基因型基因型 发生途径发生途径 继代次数继代次数 减少变异的措施：选择变异率低的品种选择变异率低的品种 选择不容易产生变异的发生途径选择不容易产生变异的发生途径 严格控制继代代数（严格控制继代代数（1010代以内）代以内）第24页/共51页继代培养常见问题继代培养常见问题2.2.玻璃化问题玻璃化问题玻璃化现象产生的主要原因：玻璃化现象产生的主要原因：一是通气不良；二是激素浓度太高；三是基因型；四是水一是通气不良；二是激素浓度太高；三是基因型；四是水分。分。培养基中可利用水的含量过高，试管苗可吸收的水分太多，培养基

23、中可利用水的含量过高，试管苗可吸收的水分太多，植物内具有过多的游离水植物内具有过多的游离水 。克服玻璃化现象的措施：克服玻璃化现象的措施：两个两个“增加增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量；两两个个“增强增强”：增强溶器通风；增强光照；：增强溶器通风；增强光照；两个两个“加入加入”：加入渗透剂：加入渗透剂 ；加入；加入ABAABA（脱落酸）；（脱落酸）；一个一个“减少减少”：减少培养基氮含量。：减少培养基氮含量。第25页/共51页第四节通过原生质体再生获取植第四节通过原生质体再生获取植物细胞物细胞原生质体原生质体(protoplast)(protoplast)：指除

24、去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体亚原生质体(subprotoplast)(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。胞质体（胞质体（cytoplastcytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。第26页/共51页第四节通过原生质

25、体再生获取植物细第四节通过原生质体再生获取植物细胞胞关于原生质体研究的重要成就：关于原生质体研究的重要成就：1880年，年，Hanstein首次起用原生质体一词。首次起用原生质体一词。1960年，年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。1971年，年，Takebe 首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1985年，年，Fujimura 第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。1986年，年，Spangenberg 单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上

26、获得成功。单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。第27页/共51页一、一、植物原生质体的材料来源植物原生质体的材料来源几几乎乎能能从从植植物物的的所所有有部部位位得得到到原原生生质质体体，其其中中以以叶叶叶叶片片片片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：1.1.取取材材容容易易，植植株株可可来来自自盆盆栽栽和和温温室室栽栽培培，也也可可在在试管中培育无菌苗。试管中培育无菌苗。2.2.原生质体在生理和遗传特性上比较一致。原生质体在生理和遗传特性上比较一致。3.3.比较容易用酶解法分离。比较容易用酶解法分离。根根根根尖尖尖尖组组组

27、组织织织织也也是是植植物物原原生生质质体体的的重重要要来来源源，它它可可由由各各种植物的种子萌发后取得。种植物的种子萌发后取得。花花花花粉粉粉粉经经特特异异酶酶处处理理也也能能得得到到原原生生质质体体，在在单单倍倍体体遗遗传育种中有特殊的用途。传育种中有特殊的用途。第28页/共51页二、二、植物原生质体的材料来源植物原生质体的材料来源原原生生质质体体也也可可以以从从组组织织培培养养的的材材料料中中大大量量获获得得。由由于于组组织织培培养养的的严严格格条条件件，使使得得材材料料的的重重复复性性好好，实实验验材材料料可可做做到常年供应。到常年供应。值值得得注注意意的的是是，在在考考虑虑分分离离植植

28、物物原原生生质质体体时时，既既要要采采用用容容易易获获得得原原生生质质体体的的植植物物材材料料，但但更更重重要要的的是是要要选选用用易易于再生完整植株的细胞。于再生完整植株的细胞。第29页/共51页第30页/共51页二二.植物原生质体的分离和纯化植物原生质体的分离和纯化(一一)原生质体的分离原生质体的分离早早在在18921892年年就就有有人人用用机机械械法法分分离离原原生生质质体体。直直到到19601960年年，英国的科金英国的科金(Cocking)(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体。首先采用酶解法分离原生质体。酶解法有下面几个优点：酶解法有下面几个优点：能获得大量的原生质体；能获

29、得大量的原生质体；条件温和，原生质体完整性好；条件温和，原生质体完整性好；原生质体纯净度高；原生质体纯净度高；下下面面以以叶叶片片和和悬悬浮浮培培养养的的细细胞胞为为材材料料介介绍绍分分离离原原生生质质体体的的一般步骤。一般步骤。第31页/共51页1.1.1.1.材料准备与表面灭菌材料准备与表面灭菌材料准备与表面灭菌材料准备与表面灭菌2.2.2.2.酶酶酶酶解解解解：用用用用镊镊镊镊子子子子撕撕撕撕去去去去叶叶叶叶子子子子的的的的下下下下表表表表皮皮皮皮后后后后，切切切切成成成成2 2 2 2厘厘厘厘米米米米见见见见方方方方的的的的小小小小片片片片，使使使使去去去去表表表表皮皮皮皮的的的的一一

30、一一层层层层朝朝朝朝下下下下放放放放入入入入酶酶酶酶液液液液中中中中处处处处理理理理，在在在在25-2825-2825-2825-28，黑黑黑黑 暗暗暗暗 下下下下 酶酶酶酶解解解解3-4hr3-4hr3-4hr3-4hr。若若若若采采采采用用用用悬悬悬悬浮浮浮浮培培培培养养养养的的的的细细细细胞胞胞胞，则则则则采采采采用用用用继继继继代代代代3d3d3d3d的的的的细细细细胞胞胞胞最最最最好好好好，经经经经离离离离心心心心收收收收集集集集细细细细胞胞胞胞，放放放放入入入入酶酶酶酶液液液液中中中中置置置置低低低低速速速速转转转转床床床床酶解酶解酶解酶解8-12hr8-12hr8-12hr8-1

31、2hr。第32页/共51页(二二)原生质体的纯化原生质体的纯化 酶解后纯化原生质体的步骤如下：酶解后纯化原生质体的步骤如下：1.1.酶酶解解悬悬浮浮液液用用400400目目的的不不锈锈钢钢或或尼尼龙龙网网过过滤滤，以以除去未消化的碎片。除去未消化的碎片。2.2.将将含含有有原原生生质质体体的的酶酶液液收收集集到到离离心心管管中中，低低速速离离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。3.3.在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。4.4.重重复复上上述述操操作作三三次次，使使酶酶解解液液充充分分除除去去，最最后后用用原生质体培养液洗涤一

32、次。原生质体培养液洗涤一次。上述的离心纯化法可细分为：上述的离心纯化法可细分为：A A沉降法；沉降法；B B漂浮法；漂浮法；C C沉降法沉降法和漂浮法结合等三种。和漂浮法结合等三种。第33页/共51页原生质体培养基分离时酶的溶剂为原生质体培养基分离时酶的溶剂为原生质体培养基甘露醇和蔗糖为渗透压调节剂甘露醇和蔗糖为渗透压调节剂在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性的稳定性第34页/共51页第35页/共51页酶溶剂用原生质体培养基或特殊配制第36页/共51页(三三)原生质体的活力测定原生质体的活力

33、测定 一是一是目测法目测法目测法目测法：凭借形态可识别原生质体的存活性。：凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用二是采用特异的染色方法特异的染色方法特异的染色方法特异的染色方法来确定：来确定：0.1%0.1%酚酚藏藏花花红红液液染染色色，活活的的原原生生质质体体能能吸吸收收而而呈呈红色，死的则无此能力；红色，死的则无此能力；伊文思蓝与之相反，仅死原生质体可吸收；伊文思蓝与之相反，仅死原生质体可吸收；荧荧光光素素双双醋醋酸酸酯酯(FDA)(FDA)染染色色，FDAFDA本本身身没没有有荧荧光光和和极极性性，可可自自由由渗渗透透进进出出完完整整质质膜膜。活活的的原原生生质质体体的的酯酯酶酶能能分

34、分解解FDAFDA成成为为具具有有荧荧光光的的极极性性物物质质，无无活力的不产生荧光。活力的不产生荧光。第37页/共51页Beforeprotoplastscanbecultureditisnecessarytotestthemforviability.第38页/共51页三三.影响原生质体分离的几个因素影响原生质体分离的几个因素 1.1.酶酶解解条条件件：酶酶质质量量、浓浓度度、酶酶解解温温度度、酶酶解解时时间间、酶酶溶溶液液的的渗渗透透压压等等。不不同同细细胞胞细细胞胞壁壁组组成成和和结结构构有有差差异异，故故酶酶的的种种类类和和浓浓度度也也不不相相同同，如如分分离离根根尖尖细细胞胞要要有有

35、较较多多的的果果胶胶酶酶；花花粉粉母母细细胞胞及及四四分分体体小小孢孢子子：蜗蜗牛牛酶酶及及胼胼胝胝质质酶酶联联合合；成成熟熟花花粉粉细细胞胞：果果胶酶和纤维素酶。胶酶和纤维素酶。酶酶液液pHpH值值也也直直接接影影响响分分离离的的速速度度和和稳稳定定性性。pHpH值值低低则则分分离离速速度度较较快快，而而损损坏坏的的较较多多；pHpH值值高高则则分分离离速速度度较较慢慢，而而完完整整性性较较好好；故故酶酶液液的的pHpH值值一一般般为为5.75.7左右。左右。第39页/共51页三三.影响原生质体分离的几个因素影响原生质体分离的几个因素 2.2.渗渗透透压压稳稳定定剂剂种种类类和和浓浓度度因因

36、材材料料不不同同而而有有变变化化。在在酶酶液液中中加加入入适适量量的的CaClCaCl2 2和和KHKH2 2POPO4 4作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性。作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性。3.3.取取材材植植株株的的生生理理状状态态也也是是重重要要的的因因素素，如如采采用用悬悬浮浮培培养养的的细细胞胞一一般般用用继继代代3d3d的的较为理想。较为理想。第40页/共51页四四.培养原生质体的几种方法培养原生质体的几种方法 原原生生质质体体经经分分离离和和纯纯化化后后，需需要要进进行行活活力力测测定定和和计计数数。原原生生质质体体培培养养时时有有一一种种密密度效应，一般度效应，一般

37、10104 45 5个个/mL/mL有利于培养。计数可用血球计数板进行。有利于培养。计数可用血球计数板进行。第41页/共51页Brassica protoplastsThe optimum plating efficiency(tobacco protoplasts)5104 protoplasts/cm3.Protoplasts fail to divide when plated at one tenth of this concentration 第42页/共51页第43页/共51页液体浅层培养液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一

38、薄层，封口后进行培养。封口后进行培养。优点：操作简单，对原生质体的操作小，且易于优点：操作简单，对原生质体的操作小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：使原生质体分布不均匀，常常发生原生质缺点：使原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。第44页/共51页固体平板培养固体平板培养固体培养也就是琼脂瑭包埋培养。低融点的琼脂固体培养也就是琼脂瑭包埋培养。低融点的琼脂糖可在糖可在3030左右融化与原生质体混合而

39、不影响原左右融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培生质体的生命活动。混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。易于统计原生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不易混合均度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不易混合均匀。匀。第45页

40、/共51页液体固体双层培养液体固体双层培养即在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表即在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。面。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。缺点：不易观察细胞的发育过程。第

41、46页/共51页琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约5050微升一滴的量滴于直径微升一滴的量滴于直径6cm6cm的培的培养皿，待其固化后向其中添加养皿，待其固化后向其中添加3ml3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团这种方法由于改善了培养物的

42、通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。的形成。第47页/共51页第五节第五节 通过花药获取花粉粒通过花药获取花粉粒花粉的分离有二种方法，即花药漂浮培养自然释放法和机械分花粉的分离有二种方法，即花药漂浮培养自然释放法和机械分离法。离法。（1 1）花药漂浮培养自然释放法：把花药接种在液体培养基上，）花药漂浮培养自然释放法：把花药接种在液体培养基上，花药漂浮于液体表面经花药漂浮于液体表面经1 17 7天的培养，药壁自然开裂，花粉自天的培养，药壁自然开裂，花粉自然散落下来，及时将花药壁从培养瓶中取出来，留下的花粉继然散落下来，及时将花药壁从培养瓶中取出来，留下的花粉继续培养，如水稻、

43、大麦等。续培养，如水稻、大麦等。第48页/共51页（2 2）机械分离方法）机械分离方法分离：分离：把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的把花药放在玻璃容器中，加入一定量适当浓度的蔗糖溶液或适量液体培养基，用注射器内径轻轻挤压花药蔗糖溶液或适量液体培养基，用注射器内径轻轻挤压花药把花粉挤出来，或用磁力搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。把花粉挤出来，或用磁力搅拌器把花药搅裂使花粉散出来。过筛：过筛：将上述混合液经过一定孔径的不锈钢网或尼龙网将上述混合液经过一定孔径的不锈钢网或尼龙网过滤。一般孔径应比花粉直径大过滤。一般孔径应比花粉直径大10um10um左右，将滤液离心，左右，将滤液离心，去上清液。去上清液。清洗：清洗：加入蔗糖液或液体培养，置加入蔗糖液或液体培养，置10010010001000转转/分离心分离心1 15 5分钟，再去上清液，如此重复分钟，再去上清液，如此重复2 23 3次。最后一次用需次。最后一次用需用培养花粉的液体培养基进行，以保证培养基成分的稳定用培养花粉的液体培养基进行，以保证培养基成分的稳定性。培养时花粉的密度一般为性。培养时花粉的密度一般为10104 410105 5个个/ml/ml。第49页/共51页第50页/共51页感谢您的观看！第51页/共51页