植物组织培养技术二.pptx
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1、 培养基:是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下,不同种植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同,只有满足了它们各自的特殊要求,它们才能很好地生长。因此,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,在建立一项新的培养系统时,首先必须找到一合适的培养基,培养才有可能成功。营养条件培养基(culture medium)A概念第1页/共90页B 培养基的种类 培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。培养基的产生最早是Sacks(1680)Sacks(1680)和Knop(1681)Knop(1681),他们对绿色植物
2、的成分进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐组成的SacksSacks和KnopKnop溶液,至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基,WhiteWhite培养基在4040年代用得较多,现在还常用。而到6060和7070年代则大多采用MSMS等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生长快、分化快,且由于浓度高,在配制、消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡。培养基的名称,一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名,如WhiteWhite培养基,MurashigeMurashige和SkoogS
3、koog培养基(简称MSMS培养基),也有对某些成分进行改良称作改良培养基。第2页/共90页(1)MS(1)MS培养基 它是19621962年由MurashigeMurashige和SkoogSkoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适,可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。有些培养基是由它演变而来的。(2)B(2)B5 5培养基 是19681968年由GalmborgGalmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵,这可能对不少培养
4、物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B B5 5培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。(3)White(3)White培养基 是19431943年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计的。19631963年又作了改良,称作WhiteWhite改良培养基,提高了MsSOMsSO4 4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低,适于生根培养。(4 4)N N6 6培养基 是19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单,KNOKNO3 3和(NHNH4 4)2 2SOSO4 4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培
5、养。(5)KM8P(5)KM8P培养基 它是19741974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂,它包括了所有的单糖和维生素,广泛用于原生质融合的培养。目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下:第3页/共90页C 培养基的成分 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。第4页/共90页是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水,以防成分的变化引起不良效果
6、。1 水第5页/共90页2 2 无机元素(inorganic element)(inorganic element)(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分,是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3N和NH4N两种形式供应。大多数培养基既含有N03N又含NH4N。NH4N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分、提供能量,而且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体
7、中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。大量元素:指浓度大于L的元素。其作用是:第6页/共90页(3)K(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K K增加时,蛋白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大,一般为13mg13mgL L为好。制备培养基时,常以KCIKCI、KN0KN03 3等盐类提供。(4)Mg(4)Mg、S S和CaCa、Mg Mg 是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S S是含S S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSOMgSO4 47H207H20提供。用量为13mg13mgl l较为适宜;CaCa是构成
8、细胞壁的一种成分,CaCa对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用,常以CaClCaCl2 22H2H2 2O O提供。第7页/共90页铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用FeFe2 2SOSO4 4,和FeClFeCl3 3(因其在pHpH值5 52 2以上,易形成Fe(OH)Fe(OH)3 3的不溶性沉淀),而用FeSOFeSO4 47H7H2 20 0和NaNa2 2EDTAEDTA结合成合物使用。B B,MnMn,ZnZn,CuCu,MoMo,CoCo等,也是植物
9、组织培养中不可缺少的元素,缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。微量元素:指小于L的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co等。第8页/共90页3 3 有机化合物(organic compound)(organic compound)培养基中若只含有大量元素与微量元素,常称为基本培养基(basic medium)basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类:第9页/共90页高压灭菌时,一部分糖会发生分解,制定配方时要给予考虑。1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%
10、3%,常用3%,即配制一升培养基称取30g蔗糖,有时可用2.5%,但在胚培养时采用4%-15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。不同植物不同组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。在大规模生产时,可用食用的绵白糖代替。第10页/共90页 V VB1B1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,V VB6B6能促进根的生长,VppVpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。VcVc有防止组织变褐的作用。2)维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动,对生长、分化等有很好的促进作用。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、
11、Vpp(烟酸)、Vc(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0110mgL。第11页/共90页3)肌醇(myoinosltol)在糖类的相互转化中起重要作用。用于构建细胞壁、细胞膜。使用浓度一般为lOOmgL。第12页/共90页4)氨基酸(alminoacide)是很好的有机氮源,可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸。用量在10-1000mgL之间。由于它们营养丰富,极易引起污染。如在培养中无特别需要,以不用为宜。第13页/共90页4 天然复合物其成分比较复杂,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用,但对器官的分化
12、作用不明显。它的成分大多不清楚,所以一般应尽量避免使用。第14页/共90页 1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%20%10%20%,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过1nun1nun时,椰乳就不发生作用。2 香蕉 用量为150-200ml150-200mlL L。用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色。对pHpH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用,对发育有促进作用。3)马铃薯(potato)(potato)去掉皮和芽后,加水煮
13、30min30min,再经过过滤,取其滤液使用。用量为150200g150200gL L。对pHpH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为100200mg100200mgL L。受酸和酶的作用易分解,使用时要注意。5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)(YE)(0.01%-0.05%),主要成分为氨基酸和维生素类;麦芽提取液(0.01%(0.01%0.5%)0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定,大多在培养困难时使用,有时有效。第15页/共90页5 植物生长调节物(hormone)植
14、物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动,在培养基的各成分中,植物生长调节物是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。第16页/共90页1)生长素类(auxin)在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对生长素最敏感。在极低的浓度下,(10-510-8rngL)就可促进生长,其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人
15、工合成的生长素类物质。第17页/共90页IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小、,高温高压易被破坏,也易被细胞中的1AA分解酶降解,受光也易分解。NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2,4D(2,4二氯苯
16、氧乙酸)起动能力比IAA高10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应。第18页/共90页在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低。2)细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌吟的衍生物,包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强,但非常昂贵,常用的是6BA。第19页/共90页有2020多种,培养基中添加的
17、是GAGA3 3。主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株。赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响,当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化,比值低时有利于韧皮部分化。GA(gibberellic acid赤霉素)第20页/共90页激素配比模式 高 有利于根的形成和愈伤组织的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织、长 根还是长芽。如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的 浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。在组织培养中一般生长素浓度的使用为L,细胞分裂素0.0510mgL。生长调节
18、物质的使用甚微,一般用mgL表示浓度。第21页/共90页GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersu
19、rface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet第22页/共90页NoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevel
20、opmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant第23页/共90页NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentof
21、rootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.第24页/共90页第25页/共90页6 培养材料的支持物 琼脂是一种由海藻中提取的
22、高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40C40C即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量在610g610gL L之间,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pHpH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失凝固能力。琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂。第26页/共90页培
23、养物与培养基的接触(即吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,培养物排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生 毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质,特别是CaCa、MgMg及其他微量元素。加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优缺点:优点:在于操作简便,通气问题易于解决,便于经常观察研究等,缺点:因此在研究植物组织或细胞的营养问题时,则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥,然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。第27页/共90页7 7 抗生物质(antibiotic)(antibiotic)抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,可能某些植物适宜用青霉
24、素,而另一些植物却不大适应。在工作中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施。在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用。注意:第28页/共90页8 8 活性炭(active carbon)(active carbon)活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,有很强的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小,吸附能力越大
25、。温度低吸附力强,温度高吸附力减弱,甚至解吸附。通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛及激素等。第29页/共90页活性炭的应用茎尖初代培养,加入适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物,其效力优于VcVc和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和伸长,但其作用有一个阈值,一般为0.1%0.2%0.1%0.2%,不能超过0.2%0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性炭减弱光照有关,可能是由于根顶端产生促进根生长的IAAIAA,但IAAIAA
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