氨基酸工业代谢控制发酵.pptx

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1、课程教学的基本要求了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业存在问题，氨基酸发酵行业发展了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业存在问题，氨基酸发酵行业发展方向方向掌握谷氨酸的生物合成途径和谷氨酸发酵调节机制，掌握谷氨酸细胞膜渗透性的掌握谷氨酸的生物合成途径和谷氨酸发酵调节机制，掌握谷氨酸细胞膜渗透性的控制方法控制方法了解谷氨酸生产菌的主要特征以及谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化，掌握了解谷氨酸生产菌的主要特征以及谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化，掌握谷氨酸发酵的代谢控制育种策略谷氨酸发酵的代谢控制育种策略第1页/共45页第一节 氨基酸工业现状及发展方向近近4040多年来，国内外在研究、

2、开发和应用氨基酸方多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已面均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由由2020世纪世纪6060年代年代5050种左右，发展到种左右，发展到2020世纪世纪8080年代的年代的400400种，目前已达种，目前已达10001000多种。其中用于药物的氨基多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达酸及氨基酸衍生物的品种达100100多种。多种。氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸。基酸。氨基酸中有氨基酸中有8 8种氨基酸人体本身不能合成，只能从种氨基酸人体本身

3、不能合成，只能从食物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是食物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是L-L-赖氨酸、赖氨酸、L-L-色氨酸、色氨酸、L-L-苏氨酸、苏氨酸、L-L-缬氨酸、缬氨酸、L-L-亮氨亮氨酸、酸、L-L-异亮氨酸、异亮氨酸、L-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸和L-L-蛋氨酸。蛋氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。第2页/共45页氨基酸的生产方法抽提法（水解蛋白质）抽提法（水解蛋白质）化学合成法化学合成法生物法（包括直接发酵法和酶转化）生物法（包括直接发酵法和酶转化）目前绝大多数氨基酸是以发酵法或酶法生产的目前绝大多数氨基酸是以发

4、酵法或酶法生产的第3页/共45页谷氨酸发酵的历史18661866年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，将此氨基酸命名为谷氨酸氨基酸，依据原料的取材，将此氨基酸命名为谷氨酸18721872年赫拉西维茨等用酪蛋白也制取了谷氨酸年赫拉西维茨等用酪蛋白也制取了谷氨酸18901890年沃尔夫利用年沃尔夫利用-酮戊酸经溴化后合成酮戊酸经溴化后合成DL-DL-谷氨酸。日本池田菊谷氨酸。日本池田菊苗教授在探讨海带汁的鲜味时，提取了谷氨酸，并在苗教授在探讨海带汁的鲜味时，提取了谷氨酸，并在19081908年开始制年开始

5、制造商品味之素造商品味之素19101910年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸。年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸。19361936年美国从甜菜废年美国从甜菜废液液(司蒂芬废液司蒂芬废液)中提取谷氨酸。中提取谷氨酸。第4页/共45页氨基酸发酵的现状自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。20002000年氨年氨基酸产量达基酸产量达237237万吨，销售额接近万吨，销售额接近4545亿美元，占生物技术产品销售额的亿美元，占生物技术产品销售额的7 7。目前氨基酸产业发展较快

6、的国家是美国、日本和中国。目前氨基酸产业发展较快的国家是美国、日本和中国。第5页/共45页我国氨基酸发酵的发展我国氨基酸生产最早在我国氨基酸生产最早在19221922年用酸法水解面筋生产谷氨年用酸法水解面筋生产谷氨酸钠即味精，在上海开办了天厨味精厂，该味精的制造酸钠即味精，在上海开办了天厨味精厂，该味精的制造方法曾向美、英、法申请专利，并取得了专利权。并先方法曾向美、英、法申请专利，并取得了专利权。并先后建立了沈阳味精厂、青岛味精厂和天津味精厂，规模后建立了沈阳味精厂、青岛味精厂和天津味精厂，规模均很小，均很小，19491949年全国味精总产量不到年全国味精总产量不到500500吨。吨。196

7、51965年发酵法生产味精取得成功，带动了其他氨基酸的年发酵法生产味精取得成功，带动了其他氨基酸的研究开发。研究开发。19651965年以后，我国味精生产全部采用以淀粉质或糖蜜为年以后，我国味精生产全部采用以淀粉质或糖蜜为原料的微生物发酵工艺，大大的促进了生产的发展，到原料的微生物发酵工艺，大大的促进了生产的发展，到19851985年全国味精生产企业达到年全国味精生产企业达到140140家。随着酶制剂的应家。随着酶制剂的应用和生产工艺及装备的改进，技术水平不断提高，进一用和生产工艺及装备的改进，技术水平不断提高，进一步推动了味精生产的快速发展。步推动了味精生产的快速发展。发酵法发酵法L-L-赖

8、氨酸生产起步于赖氨酸生产起步于2020世纪世纪7070年代，当时仅有年代，当时仅有上海天厨味精厂少量生产，以实用为主，上海天厨味精厂少量生产，以实用为主，19811981年在广西年在广西建成年产建成年产100100吨食品级吨食品级L-L-赖氨酸试验工厂，于赖氨酸试验工厂，于19871987年投年投产。产。第6页/共45页氨基酸发酵的发展动向新技术和工艺的开发应用新技术和工艺的开发应用1.现代生物技术在氨基酸工业中的应用2.生物化工技术在氨基酸工业中的应用新产品的开发、新应用领域的拓展新产品的开发、新应用领域的拓展1.医药中间体2.肽类3.多聚氨基酸4.氨基酸系表面活性剂第7页/共45页第二节第

9、二节 微生物代谢控制发酵微生物代谢控制发酵微生物代谢调节微生物代谢调节 1 1、时序调节、时序调节(temporal regulation)(temporal regulation)微生物对生长、发育、分化不同生理时期的代谢调微生物对生长、发育、分化不同生理时期的代谢调节节 2 2、适应调节、适应调节 微生物对细胞内外环境的变化作出应答性调节微生物对细胞内外环境的变化作出应答性调节微生物的经济化学与合目的性微生物的经济化学与合目的性 Economic BiochemistryEconomic Biochemistry（经济化学）：微生物利（经济化学）：微生物利于生存发生的所有生化反应皆有精确计

10、算，有很高经于生存发生的所有生化反应皆有精确计算，有很高经济效益济效益 Telenomic Telenomic（合目的性）：微生物按需要有目的进（合目的性）：微生物按需要有目的进行物质合成的能力行物质合成的能力第8页/共45页一、代谢控制发酵的定义一、代谢控制发酵的定义代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累初级代谢产物；人为解除正常代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累初级代谢产物；人为解除正常代谢调节，而大量积累初级代谢产物的发酵方式。代谢调节，而大量积累初级代谢产物的发酵方式。代谢控制发酵方法代谢控制发酵方法：1 1、发酵条件控制、发酵条件控制 2 2、菌种遗传改造、菌种遗传改

11、造第9页/共45页1 1、分解代谢降解物阻遏、分解代谢降解物阻遏 分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对难利用或利用分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对难利用或利用快对利用慢底物分解的抑制作用。快对利用慢底物分解的抑制作用。2 2、解除分解代谢降解物阻遏的技术与方法、解除分解代谢降解物阻遏的技术与方法 发酵条件控制发酵条件控制 加入安慰诱导物：如加入安慰诱导物：如LacLac结构类似物结构类似物IPTGIPTG 抗降解物阻遏突变株的选育抗降解物阻遏突变株的选育 加入高浓度底物筛选仍产生大量目的产物的突变株加入高浓度底物筛选仍产生大量目的产物的突变株二、分解代谢降解物阻遏二

12、、分解代谢降解物阻遏第10页/共45页反馈调节作用反馈调节作用1 1、终产物反馈阻遏和反馈抑制、终产物反馈阻遏和反馈抑制 野生型菌株野生型菌株“A”A”氨基酸合成操纵子模型氨基酸合成操纵子模型ARPOA结构基因无活性repressorARNA聚合酶反馈阻遏活性A合成酶系（E1,E2）A反馈抑制超过生理需要量野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏第11页/共45页 野生型菌株酶活性水平的反馈抑制野生型菌株酶活性水平的反馈抑制过量过量A A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活Gene编码酶效应物位点 过量A酶活中心第12页/共45页反馈阻遏与反馈

13、抑制比较反馈阻遏与反馈抑制比较 反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制控制对象酶合成酶活性控制量终产物浓度终产物浓度控制水平转录水平酶构象变化控制装置终产物与阻遏蛋白亲和终产物与控制酶构象的部位亲和控制装置的动作阻遏蛋白与操纵子基因结合,不转录mRNA酶构型变化，活性中心失活形成控制开关控制酶活性大小控制反应迟缓，粗控制迅速，精控制细胞经济超高效益高效益第13页/共45页2 2、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育野生型菌株诱变解除反馈调节突变株AR-或AO-AR-AO-酶基因突变 解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物筛选方法

14、：筛选方法：解除解除Lys反馈调节突变株筛选反馈调节突变株筛选野生型菌株诱变菌细胞正常反馈调节型解除反馈调节突变型第14页/共45页第三节第三节 谷氨酸的生物合成途径谷氨酸的生物合成途径生产谷氨酸的主要菌株生成谷氨酸的主要酶反应谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸发酵的代谢途径第15页/共45页 GluGlu发酵常用菌种发酵常用菌种 谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌()()北京棒杆菌北京棒杆菌(AS.1229)(AS.1229)黄色短杆菌黄色短杆菌(Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum)乳糖发酵短杆菌乳糖发酵短杆菌()()第16页/共45页谷氨酸的生物合成包括

15、谷氨酸的生物合成包括 糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（glycolysis,EMPglycolysis,EMPglycolysis,EMPglycolysis,EMP途径）途径）途径）途径）戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathway，HMPHMPHMPHMP途径）途径）途径）途径）三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（tricarboxylic acid c

16、ycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycle）乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（COCOCOCO2 2 2 2固定反应）等固定反应）等固定反应）等固定反应）等第17页/共45页由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径第18页/共

17、45页谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径p生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经，另一部分经CO2固定反应生成固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。p草酰乙酸与乙酰草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠

18、檬酸，异柠檬酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成成-酮戊二酸，酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体合成的直接前体。p-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸经还原氨基化反应生成谷氨酸第19页/共45页CO2固定酶系活力强Citrate synthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱谷氨酸脱氢酶能力强l控制谷氨酸合成的重要措施第20页/共45页l乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的

19、代谢途径乙醛酸循环途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循可看作三羧酸循环的支路和中间环的支路和中间产物的补给途径产物的补给途径在菌体生长期之在菌体生长期之后，进入谷氨酸后，进入谷氨酸生成期，为了大生成期，为了大量生成、积累谷量生成、积累谷氨酸氨酸 ，最好没有，最好没有异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭催化反应，封闭乙醛酸循环乙醛酸循环第21页/共45页第四节第四节 谷氨酸生物合成的调节机制谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节生物素的调节作用第22页/共45页l优先合成 谷谷氨氨酸酸比比天天冬冬氨氨酸酸优优先先合合成成，谷谷氨氨酸酸合合成成过过量量后后，就就会会抑抑制制和和阻阻遏遏自自身

20、身的的合合成成途途径径，使使代代谢谢转转向向合合成成天天冬冬氨氨酸酸l柠檬酸合成酶的调节 柠柠檬檬酸酸合合成成酶酶是是三三羧羧酸酸循循环环的的关关键键酶酶，除除受受能能荷荷调调节节外外，还还受受谷谷氨氨酸酸的的反反馈馈阻阻遏遏和和顺顺乌乌头头酸酸的的反反馈馈抑抑制制一、优先合成与反馈调节第23页/共45页l-酮戊二酸脱氢酶的调节在在谷谷氨氨酸酸产产生生菌菌中中，-酮酮戊戊二二酸酸脱脱氢氢酶酶活活性性微微弱弱l谷氨酸脱氢酶的调节 谷谷氨氨酸酸对对谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶存存在在着着反反馈馈抑抑制制和和反反馈馈阻阻遏遏-酮酮戊戊二二酸酸合合成成后后由由于于-酮酮戊戊二二酸酸脱脱氢氢酶酶活活性性微微

21、弱弱，谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶的的活活力力很很强强，故故优优先先合合成成谷谷氨氨酸酸第24页/共45页Glc丙酮酸草酰乙酸CO2天门冬氨酸（Asp）AC-coACO2羧化酶柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸-酮戊二酸Glu反馈抑制谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶合成酶反馈阻遏第25页/共45页GluGlu产生菌主要生理生化特性产生菌主要生理生化特性 需氧，生物素缺陷型需氧，生物素缺陷型biobio-,有乙醛酸循环，羧化酶活性强（有乙醛酸循环，羧化酶活性强（biobio作为辅酶）作为辅酶）柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，GluGlu合成中存在正常反馈阻遏合成中存在正常

22、反馈阻遏和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于GluGlu胞外分泌。胞外分泌。二、生物素对代谢的调控作用二、生物素对代谢的调控作用第26页/共45页l 生物素对生物素对CO2CO2固定反应的影响固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2CO2固固定反应，据报道，生物素大过量时（定反应，据报道，生物素大过量时（100100 g/Lg/L以以上），上），CO2CO2固定反应可提高固定反应可提高30%30%。第27页/共45页l 生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响 生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽

23、生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出l 生物素对乙醛酸循环的影响生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥

24、珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊酮戊二酸二酸谷氨酸的方向高效率地移动。谷氨酸的方向高效率地移动。第28页/共45页l生生物物素素控控制制磷磷脂脂的的合合成成使使用用生生物物素素缺缺陷陷型型菌菌株株进进行行谷谷氨氨酸酸发发酵酵，通通过过限限制制发发酵酵培培养养基基中中生生物物素素的的浓浓度度控控制制脂脂肪肪酸酸生生物物合合成成，从从而而控控制制磷磷脂脂的的合合成成作作用用机机制制：生生物物素素作作为为催催化化脂脂肪肪酸酸生生物物合合成成最最初初反反应应的的关

25、关键键酶酶乙乙酰酰C Co oA A羧羧化化酶酶的的辅辅酶酶，参参与与了了脂脂肪肪酸酸的的合合成成，进进而而影影响响磷磷脂脂的的合合成成。当当磷磷脂脂合合成成减减少少到到正正常常量量的的一一半半左左右右时时，细细胞胞变变形形，谷谷氨氨酸酸向向膜膜外外漏漏出出，积积累累于于发发酵酵液液中中第29页/共45页控制生物素添加量使菌种生产控制生物素添加量使菌种生产GluGlu 高浓度高浓度biobio增强羧化酶活性，促进羧化反应利于增强羧化酶活性，促进羧化反应利于GluGlu合成。低浓度合成。低浓度biobio降降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸

26、循环，使底物流向GluGlu合成，低浓度合成，低浓度biobio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于GluGlu胞外分泌，解除反馈调节，利胞外分泌，解除反馈调节，利于于GluGlu合成并大量积累。合成并大量积累。添加亚适量，添加亚适量，5-10g/L 5-10g/L 培养基，生产培养基，生产GluGlu第30页/共45页 培养前期，培养前期，bio充足，存充足，存在乙醛酸循环，中间物质在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累调节，不积累Glu，细胞，细胞形态正常。形态正常。8h

27、rGlu非积累型细胞Glu积累型细胞 培养中后期，培养中后期，bio浓度渐浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未，细胞形态异常，未溶解。溶解。第31页/共45页第五节第五节 LysLys代谢控制发酵代谢控制发酵生产菌种生产菌种 谷氨酸棒杆菌（）谷氨酸棒杆菌（）黄色短杆菌黄色短杆菌(B.flavum)(B.flavum)乳糖发酵短杆菌乳糖发酵短杆菌()()2 2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌LysLys合成途径及

28、正常调控机制合成途径及正常调控机制 第32页/共45页Asp 天冬氨酸Asp 激酶天冬氨酸-P天冬氨酸-半醛高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸O-琥珀酰-高丝氨酸蛋氨酸(Met)高丝氨酸-P苏氨酸（Thr）异亮氨酸（Ile）Thr脱氢酶赖氨酸(Lys)Hse脱氢酶DDP合成酶合成酶第33页/共45页Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、Ile，最后合成LysThr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏第34页/共45页3.Lys 3.Lys 代谢控制发酵代谢控制发酵 菌种的遗传改造菌种的遗传

29、改造(1)(1)切断支路代谢切断支路代谢HseHse营养缺陷型营养缺陷型(Hse(Hse-)菌株筛菌株筛选选 选育选育HseHse脱氢酶缺失的脱氢酶缺失的HseHse-菌株，使代谢菌株，使代谢流向流向LysLys合成，控制合成，控制HseHse添加量，既满足菌体对添加量，既满足菌体对MetMet、ThrThr和和IleIle生长需要又不形生长需要又不形ThrThr和和LysLys对对AspAsp激酶的协同反馈抑制，积累激酶的协同反馈抑制，积累LysLys(2)(2)用用HseHse-菌株选育解除菌株选育解除LysLys反馈抑制突变株反馈抑制突变株Hse-诱变Hse-Lys反馈抑制Hse-抗Ly

30、s反馈抑制长出菌落 (Hse-,AECr)基本培养基Hse(高浓度)AEC(Lys结构类似物)Hse-,AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同反馈抑制，大量积累Lys第35页/共45页(3)Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株日本椎尾等人 黄色短杆菌 突变株 亚硝基胍Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长代谢流转向Lys大量合成Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，大量积累Lys，产量达25g/L第36页/共45页(4)Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量谷氨酸棒杆菌 H

31、se 13g/LHseAECR 中山清（日本）42g/L黄色短杆菌 HseAECRCSIFps 51g/L(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维 50-55g/L钝齿棒杆菌 pI-3-2 Hse-AECr 陈琦 50g/L第37页/共45页(5)乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌。特殊调控：代谢互锁调控机制 互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径产物反馈调节Lys生产菌种遗传标记和产量：HseAECRLeu 110g/L（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁

32、调节）HseAECRLeu-TARAla 110g/L（加Hse、Leu，限量加Ala，-TA是Leu结构类似物）第38页/共45页AspAsp激酶Asp-PAsp-半醛HseMetThrLysIleDDP协同反馈抑制DDP还原酶DDP合成酶反馈抑制AlaLeu反馈阻遏第39页/共45页第六节 产氨基酸菌种的分离、检测原理与方法1、营养缺陷型补充营养检测法影印接种His产生菌大量UV照射细胞死亡鉴定生长区丰富细菌培养基平板分离产氨基酸培养基基本培养基E.coli His混合上层培养基鉴定菌：各种氨基酸营养缺陷型第40页/共45页2、可逆抑制测定法-2-噻吩丙氨酸（抑制剂）L-苯丙氨酸（解除抑制

33、剂）培养基枯草杆菌（指示菌）生长不生长 原理：指示菌在抑制剂存在条件下生长，证明存在解除抑制剂；原理：指示菌在抑制剂存在条件下生长，证明存在解除抑制剂；指示菌不生长，证明不存在解除抑制剂。用氨基酸的结构类似物作指指示菌不生长，证明不存在解除抑制剂。用氨基酸的结构类似物作指示菌生长抑制剂，通过指示菌是否生长而判断是否存在解除抑制剂氨示菌生长抑制剂，通过指示菌是否生长而判断是否存在解除抑制剂氨基酸。基酸。上层培养基有指示菌影印接种有抑制剂L-丙氨酸产生菌枯草杆菌生长区丰富细菌培养基平板分离产氨基酸培养基枯草杆菌生长区对应菌落目的菌第41页/共45页可逆抑制测定方法：可逆抑制测定方法：根据特异性解除

34、抑制剂对指示菌生长抑制，让指示菌生根据特异性解除抑制剂对指示菌生长抑制，让指示菌生长而检测氨基酸的方法长而检测氨基酸的方法 适用于检测氨基酸的可逆性抑制剂测定法适用于检测氨基酸的可逆性抑制剂测定法被检测氨被检测氨基酸基酸抑制剂抑制剂指示菌指示菌AlaL-氨基乙基磺酸氨基乙基磺酸普通变形杆菌普通变形杆菌Arg高丝氨酸高丝氨酸E.coli BAsp羟基天冬氨酸羟基天冬氨酸胚芽乳杆菌胚芽乳杆菌ATCC 8014Leu2-氨基氨基-4-甲基乙酸甲基乙酸E.coli ATCC 9723Ser氨基丝氨酸氨基丝氨酸啤酒足球菌啤酒足球菌ATCC 8042第42页/共45页总 结 氨基酸高产菌株代谢控制发酵基本规律氨基酸高产菌株代谢控制发酵基本规律1 1、以合成途径与代谢调控为理论依据、以合成途径与代谢调控为理论依据2 2、三类常用突变株、三类常用突变株 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株 解除反馈调节突变株解除反馈调节突变株 膜透性突变株膜透性突变株 生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素或或或或 表面活性剂处理表面活性剂处理表面活性剂处理表面活性剂处理第43页/共45页思考题思考题控制代谢发酵的基本方法第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页