液相色谱基础--1.pptx

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1、液相色谱基础知识SHIMADZU第1页/共38页液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法v适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析v流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法v适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析v流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱基础知识第2页/共38页液相色谱基础知识液相色谱流程图液相色谱流程图溶剂输液泵进样器柱温箱检测器数据处理第4页/共38页液相色谱基础知识采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相的选择第5页/共38页溶

2、剂 等 级水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸吸光光率率第6页/共38页水/MeOH梯度ODS 柱鬼峰Gradient Curve1 ml/min,0-100%MeOHover 10 mins and hold for15 mins.溶 剂 等 级鬼峰的出现鬼峰的出现第7页/共38页溶 剂 等 级溶剂的等级溶剂的等级HPLCHPLCHPLCHPLC级级优级纯优级纯分析纯分析纯都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂

3、HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱第8页/共38页甲醇 乙睛 正己烷分析纯级和HPLC 级溶剂的吸光度比较图溶 剂 等 级第9页/共38页General Maintenance and Troubleshooting缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min易受到细菌和霉菌的影响 溶 剂 等 级不能直接用有机溶剂冲洗第10页/共38页过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液

4、。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意：1）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长溶 剂 前 处 理第11页/共38页岛津岛津VP系列输液泵系列输液泵目的 单元 流速范围特性和应用 分析 LC-10ADVP0.001-9.999无脉动，适于半微量LC 和 LC-MS LC-10ATVP0.001-9.999非凡的耐用性，适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度液相色谱基础知识第12页/共38页LC-10ATvp泵：

5、串联式往复泵LC-10ADvp泵：并联式微体积往复泵LC-10ADVP/LC-10ATVP工作原理第13页/共38页单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头LC-10ADVP/LC-10ATVP工作原工作原理理第14页/共38页液相色谱基础知识梯度洗脱形式：v线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例v指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系v折线梯度：梯度洗脱装置：梯度洗脱装置：v高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入v低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。第15页/

6、共38页梯度洗脱形式的选择第16页/共38页1.使用流动相溶解样品 -减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 -保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀 2.进样前最好使用0.45um 的膜进行过滤 如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤样 品 处 理第18页/共38页进样器进样器自动进样器手动进样器 原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入 2）部分注入液相色谱基础知识第19页/共38页进样量和检测器响应的关系示意图液相色谱基础知识进样体体积 检测器响应值定量定量环体体积的一半的一半3倍定量倍定量环体体积全量注入全量注入部分注入部分注入第20页/共38页手动进样

7、器的原理图手动进样器的原理图 装填状态液相色谱基础知识进样状态第21页/共38页交叉污染的原因交叉污染的原因微量注射器 红色表示残留样品第22页/共38页手动进样法手动进样法一般的方法 1.在进样状态下清洗针口 2.在装填状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到进样状态第23页/共38页手动进样法便捷的方法（不需清洗）1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态第24页/共38页柱温箱柱温箱分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 液相色谱基础知识第25页/共38页v柱压低于150kgf/cm2v柱温在40左右，最高使用温度为50v缓冲液PH使用范

8、围为27v流动相有机溶剂比例过低,柱效下降快返回ODSODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：柱的使用注意点：柱的使用注意点：硅胶在硅胶在硅胶在硅胶在PHPHPHPH为为为为3 3 3 34 4 4 4时稳定性最好时稳定性最好时稳定性最好时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。液相色谱基础知识第26页/共38页硅胶基底聚合物基底pH 范围2-7.5宽范围有机溶剂所有有限制压力 250 kgf/cm2低压温度宽范围60C液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围第

9、27页/共38页分 析 柱 的 维 护1.在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下(0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样 处理2.定期使用强溶剂冲洗柱子3、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯第28页/共38页常用检测器常用检测器常用检测器常用检测器v紫外检测器（包括二极管阵列检测器）v荧光检测器v示差折光检测器v电导检测器液相色谱基础知识第29页/共38页v原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收v定量基础：比耳定律，AKCLv优点：1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3

10、）可用于梯度洗提v缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质紫外检测器第30页/共38页二极管阵列检测器第31页/共38页二极管阵列检测器（SPDM10AVP）-二十一世纪标准紫外检测器色谱定性依据：保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器液相色谱基础知识第32页/共38页 样品池二极管阵列光栅D2/W 灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器第33页/共38页1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰二极管阵列检测器的优点第34页/共38页vv原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测原理：基于被分

11、析组分发射的荧光强度进行检测原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测vv优点：优点：优点：优点：1 1 1 1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一 2 2 2 2）选择性好）选择性好）选择性好）选择性好 3 3 3 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱vv缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质缺点：仅适用于测定可产生荧光的

12、物质vv可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）荧光检测器第35页/共38页v原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。v优点：通用型检测器，v缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3）属于中等灵敏度的检测器示差折光检测器第36页/共38页v原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法v优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱v缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)v主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子返回电导检测器第37页/共38页感谢您的观看！第38页/共38页