肿瘤细胞与分化凋亡一.pptx
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1、前 言大量研究证明,肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因大量研究证明,肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果。其特点是多因素(环境因素,如物理、化共同作用的结果。其特点是多因素(环境因素,如物理、化学、生物等;机体因素,如遗传、免疫、年龄与性别等)交学、生物等;机体因素,如遗传、免疫、年龄与性别等)交互作用,有的起致癌作用,即诱导细胞恶性转化,有的起促互作用,有的起致癌作用,即诱导细胞恶性转化,有的起促癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等癌作用。肿瘤的发生发展经历了启动、促发、侵袭、转移等阶段。并且,各阶段都可能发生多种癌基因激活、抑癌基因阶段。并且,各阶段都可能发生多
2、种癌基因激活、抑癌基因失活。表现为失活。表现为增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻增生过度、分化异常、凋亡受阻。第1页/共94页 长期以来,长期以来,长期以来,长期以来,“细胞一旦癌变后,就永远是癌细胞细胞一旦癌变后,就永远是癌细胞细胞一旦癌变后,就永远是癌细胞细胞一旦癌变后,就永远是癌细胞”的观点一直统治着肿瘤学领域,即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域,即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域,即恶性肿瘤是不能逆转的观点一直统治着肿瘤学领域,即恶性肿瘤是不能逆转的。在这种思想指导下,传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导
3、下,传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导下,传统的肿瘤治疗不外乎外科手的。在这种思想指导下,传统的肿瘤治疗不外乎外科手术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。术切除、化疗、放射或免疫治疗。19711971年,年,年,年,FriendFriend报告报告报告报告小鼠红白血病细胞(小鼠红白血病细胞(小鼠红白血病细胞(小鼠红白血病细胞(MELMEL)可被二甲基亚砜()可被二甲基亚砜()可被二甲基亚砜()可被二甲基亚砜(DMSODMSO)诱导分化,开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前,诱诱导分化,开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前,诱诱导分化,开
4、创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前,诱诱导分化,开创了肿瘤细胞分化研究的先河。目前,诱导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。导肿瘤细胞分化的已经成为重要研究前沿。细胞分化与肿瘤细胞分化与肿瘤第2页/共94页一、肿瘤细胞诱导分化的有关概一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念念1.分化分化(differentiation)细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。如人起源于一个受精卵,通过细胞分裂形成内、中、外三个胚层细胞。第3页/共94页2.反分化反分化(retro-differentiati
5、on)又称去分化又称去分化(dedifferentiation),肿瘤的反分化,肿瘤的反分化是指细胞恶变后,细胞的多种表型又回到胚胎细胞是指细胞恶变后,细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象表型的现象。恶性肿瘤细胞表现分化异常,不成熟。恶性肿瘤细胞表现分化异常,不成熟。第4页/共94页3.3.再分化再分化(redifferentiation)又又称称逆逆转转(reversion),它它是是指指在在分分化化诱诱导导剂剂的的作作用用下下,恶恶性性肿肿瘤瘤细细胞胞被被诱诱导导而而重重新新向向正正常常细细胞胞的的方方向向演演变变分分化化,表表现现为为形形态态学学、生生物物学学、生生物物化化学学等等诸诸
6、多多指指标标均均向向正正常常细细胞胞接接近近,甚至完全转变为正常细胞。甚至完全转变为正常细胞。第5页/共94页二、分化诱导剂二、分化诱导剂1.1.内源性分化诱导剂内源性分化诱导剂 内内源源性性分分化化诱诱导导剂剂是是由由肿肿瘤瘤或或宿宿主主细细胞胞产产生生的的具具有有分分化化诱导作用的化学物质。它有以下几种:诱导作用的化学物质。它有以下几种:集落刺激因子(集落刺激因子(CSF):分为):分为CSF-M和和CSF-G;粒细胞巨噬细胞分化因子(粒细胞巨噬细胞分化因子(GMDF););类类固固醇醇类类化化合合物物:如如糖糖皮皮质质激激素素和和1,25-(OH)2-vitD3;细胞因子细胞因子:如如T
7、NF-和和INF-;糖脂糖脂:如神经节苷脂如神经节苷脂GM3;其它,如其它,如cAMP等。等。第6页/共94页2.2.外源性分化诱导剂外源性分化诱导剂 可分为以下几类:可分为以下几类:无机化合物:亚硒酸钠等。无机化合物:亚硒酸钠等。简单的有机化合物:正丁酸、二甲基亚砜简单的有机化合物:正丁酸、二甲基亚砜(DMSO)、六次、六次甲基二乙酰胺甲基二乙酰胺(HMBA)等。等。维生素维生素A类化合物:维甲酸、类化合物:维甲酸、AM80、芳维甲等。、芳维甲等。佛波酯类化合物:佛波酯类化合物:12-O-十四酯酰佛波十四酯酰佛波-13-乙酸乙酸(TPA)。抗生素类:放线菌素抗生素类:放线菌素D、丝裂霉素等;
8、、丝裂霉素等;抗癌药:抗癌药:6-巯基嘌呤、巯基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。氮胞嘧啶等。第7页/共94页三三、诱导肿瘤分化的研究、诱导肿瘤分化的研究 1.1.体外分化诱导模型体外分化诱导模型(1)(1)白血病细胞分化诱导模型白血病细胞分化诱导模型 最最常常用用的的是是急急性性髓性白白血血病病细细胞胞株株HL-60。它它在在分分化化诱诱导导剂剂作作用用下下可可出出现现分分化化表表型型如如形形态态上上由由早早幼幼粒粒白白血血病病细细胞胞分分化化为为中中、晚晚幼幼粒粒、杆杆状状核核细细胞胞和和分分叶叶核核细细胞胞,生生化化方方面面出出现现硝硝基基蓝蓝四四氮氮唑唑还还原原性性(NBT),功功能能方方面面出出
9、现现吞吞噬噬活活性性及及趋趋化化性性,生生物物学学方方面面丧丧失失了了在在软软琼琼脂脂培培养养基基上上形形成成集集落落及及裸裸鼠鼠体体内内移移植植成成活的能力。活的能力。第8页/共94页(2)(2)实体瘤分化诱导模型实体瘤分化诱导模型 人人胃胃癌癌分分化化诱诱导导模模型型国内外有人用DMSO、HMBA、suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时,癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学等方面均出现分化特征。人人神神经经母母细细胞胞瘤瘤分分化化诱诱导导实实验验 在正丁酸、苯丁酸及其盐类作用后,瘤细胞可形成树突状结构,功能上能产生神经递质合成酶,生物学上其致瘤性明显降低,表
10、现出分化的特点。第9页/共94页 人人粘粘液液表表皮皮样样癌癌分分化化诱诱导导实实验验 MEC-1细胞是上皮样细胞,体外增殖迅速,形态异型性明显,裸鼠体内成瘤性,在HMBA的作用下出现分化表型:生长抑制、核异型性降低、表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒、DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。其其它它实实体体瘤瘤分分化化诱诱导导模模型型其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。第10页/共94页 2.2.体内分化诱导模型体内分化诱导模型 目前,体内分化诱导尚无理想的模型。人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法;人实体瘤采用小鼠肾包膜下
11、移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。分化诱导效果主要根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长,细胞标记酶、抗原以及形态的变化来判断。国内用NB4细胞株建立了SCID小鼠人APL腹水细胞模型,在ATRA作用下能发生分化,如明显提高NBT还原率和CD11b的表达,小鼠的生存期明显延长。该模型的建立是评价新的或已有的治疗APL药物和临床前期实验研究的理想模型。第11页/共94页3.3.分化诱导的临床试验分化诱导的临床试验 尽管诱导分化研究取得了成绩,但其最终目的是能应用于临床,ATRA治疗APML能有效地达到临床缓解,被认为是人类恶性肿瘤分化治疗的成功典范。ATRA能诱导APL病人恶性肿瘤细胞分化成熟,口服AT
12、RA可使大多数患者达到完全临床缓解,即使是传统化疗失败后亦是如此。在欧洲的随机实验证实,ATRA加化疗比单用化疗方案能明显降低复发率和延长生存期。第12页/共94页四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制1.1.核内受体途径核内受体途径 维甲类化合物诱导肿瘤细胞分化主要通过核内受体途径。维甲酸受体(RAR)是广泛存在各种组织细胞核内的一类受体蛋白,有RARS和RXRS两类,每一类又有、三种类型,比较其DNA序列和结构特点,二者属于类固醇-甲状腺素-vitD3受体在内的核内受体超家族。在细胞液内存在RA结合蛋白,能将RA从细胞浆运输到核内染色体上的受体部位,自身则释放回到胞浆
13、。RA经胞质内RA结合蛋白运输到染色体上的受体部位,与核受体以二聚体形式结合某些靶序列,进而引起特定基因的转录激活或转录抑制来诱导细胞分化。第13页/共94页 Manfredini等用ATRA和vitD3诱导白血病母细胞分化实验中发现,M0、M1对二者不敏感,M3在ATRA诱导下向粒细胞方向分化,M2则在二者诱导下向单核细胞分化。进一步研究方发现,ATRA和vitD3有效地增加核内VDR,VDR与RXR形成二聚体,再结合到DR3型VD反应元件,从而激活VD反应元件调控的报告基因的转录,启动了M2向单核细胞方向分化。第14页/共94页 2.影响基因转录影响基因转录 Naka 等等用用9-cis-
14、维维甲甲酸酸诱诱导导胃胃癌癌细细胞胞株株分分化化研研究究中中,发发现现大大多多数数胃胃癌癌细细胞胞株株能能合合成成RARs和和RXRs mRNA,其其中中一一些些细细胞胞株株并并不不停停滞滞于于G0/G1期期,但但可可一一过过性性增增加加p21WAF1蛋蛋白白表表达达,降降低低CDK7、EGFR及及cyclinD蛋蛋白白量量,减减少少Rb基基因因产产物物磷磷酸酸化化。认认为为9-cis-维维甲甲酸酸抑抑制制细细胞胞生生长长是是通通过过调调控控细细胞胞周期,影响维甲酸受体周期,影响维甲酸受体mRNA转录来实现的。转录来实现的。第15页/共94页 Okabe 发发现现TPA可可诱诱导导Ph阳阳性性
15、白白血血病病细细胞胞 MC3向向巨巨核核细细胞胞系系分分化化,血血小小板板糖糖蛋蛋白白GPb表表达达增增强强,GPb mRNA水水平平增增高高,处处理理组组有有GATA-1表表达达,而而GATA-3不不表表达达,未未处处理理组组仅仅GATA-2转转录录。TPA则则通通过过影影响响GPb及及GATAs转转录录来来诱诱导导MC3细胞分化。细胞分化。Garingo在在诱诱导导MEL分分化化中中发发现现红红细细胞胞特特异异性性基基因因转转录录活活化化,PKA缺缺陷陷时时则则转转录录出出现现障障碍碍。转转录录因因子子NF-E2是是提提高高球球蛋蛋白白位位点点控控制制区区活活性性的的必必须须成成分分。DN
16、A与与NF-E2结结合合,-球球蛋蛋白白位位点点控控制制区区增增强强子子活活性性在在PKA缺缺陷陷细细胞胞中中明明显显低低于于具具有有PKA活活性性的的细细胞胞,PKA对对转转录录因因子子的的调调控控影影响响了了红红细细胞胞特特异异基基因因转转录录而诱导而诱导MEL细胞分化。细胞分化。第16页/共94页研究表明,染色质重塑在基因转录调控中有重要作用,而组蛋白乙酰化、去乙酰化修饰是影响染色质重塑的重要因素。我们前期研究的基础上,建立人胃癌MGC803细胞裸鼠移植瘤模型,以被证实有显著诱导肿瘤细胞分化的药物丁酸钠(Sodiumbutyrate,SB)为阳性对照,观察DADS(diallyldisu
17、lfide)在体内外诱导MGC803细胞分化时,对其核组蛋白乙酰化表达的调控作用,以及二者之间的关系,进一步探讨DADS对MGC803细胞抑制和诱导分化的作用机理。第17页/共94页 H3-actinDADS(mgL-1):15 30 60 30SB(mM):5 5DADS对体外培养对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响细胞组蛋白乙酰化的影响第18页/共94页H4-actinDADS(mgL-1):15 30 60 30SB(mM):5 5DADS对体外培养对体外培养MGC803细胞组蛋白乙酰化的影响细胞组蛋白乙酰化的影响第19页/共94页p21WAF1-actin处理时间处理时间(h)
18、:12h 24h 12h 24h 12h 24h 12h 24hDADS(mgL-1):0 0 15 15 30 30 60 60DADS对对MGC803细胞细胞p21WAF1蛋白表达的影响蛋白表达的影响第20页/共94页DADS对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响对各组移植瘤组织中乙酰化组蛋白表达的影响H3-actin各处理因素各处理因素 :NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1):66 50 100 200第21页/共94页H4-actin各处理因素各处理因素 :NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1):66 50 100 200第22页
19、/共94页DADS对移植瘤细胞对移植瘤细胞p21WAF1表达的影响表达的影响p21WAF1-actin各处理因素各处理因素 :NS SB DADS DADS DADS浓度浓度(mgkg-1):66 50 100 200第23页/共94页3 3.对癌基因和抑癌基因的影响对癌基因和抑癌基因的影响 细细胞胞的的基基因因控控制制细细胞胞的的生生长长与与分分化化,而而这这些些基基因因的的变变化化则则影影响响基基因因的的表表达达或或功功能能被被认认为为是是癌癌变变的的主主要要原原因因。Ras基基因因在在细细胞胞内内有有H-,K-,N-Ras,编编码码分分子子量量为为21kd的的蛋蛋白白,p21Ras蛋蛋白
20、白具具有有GTP酶酶活活性性。Ras能能使使3T3细细胞胞恶恶性性转转化化,促促使使细细胞胞增增殖殖。C-myc过过表表达达可可以以促促进进基基因因转转录录和和细细胞胞分分裂裂,与与肿肿瘤瘤的的形形成成关关系系密密切切。P53基基因因编编码码P53蛋蛋白白,P53蛋蛋白白有有野野生生型型和突变型,野生型和突变型,野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。第24页/共94页 李李晓晓光光等等用用大大蒜蒜油油诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化和和凋凋亡亡研研究究中中,发发现现处处理理组组细细胞胞形形态态接接近近正正常常细细胞胞,细细胞胞的的致致瘤瘤性性明明显
21、显下下降降,Northern杂杂交交有有P53和和P21表表达达增增强强,提提示示大大蒜蒜油油通通过过促促进进抑抑癌癌基基因因P53、P21的的表表达达,抑抑制制细细胞胞恶恶性性增增殖殖、诱诱导凋亡和促进细胞分化。导凋亡和促进细胞分化。王王代代树树等等用用HMBA诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化时时发发现现C-myc和和C-H-ras表表达达抑抑制制。Naka 用用9-顺顺-维维甲甲酸酸诱诱导导胃胃癌癌细细胞胞分分化时则有化时则有P21蛋白一过性增加。蛋白一过性增加。这这些些基基因因在在诱诱导导癌癌细细胞胞分分化化过过程程中中的的改改变变进进一一步步影影响响其其调控的基因表达而实现瘤细胞分
22、化的效应。调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应。第25页/共94页 我我们们发发现现,DADS作作用用下下,MGC803细细胞胞明明显显抑抑制制,且且呈呈剂剂量量-效效应应依依赖赖关关系系;瘤瘤细细胞胞对对Con A的的凝凝集集率率、集集落落形形成成率率与与ALP比比活活性性下下降降;瘤瘤细细胞胞异异形形性性降降低低,核核浆浆比比下下降降,细细胞胞表表面面微微绒绒毛毛数数目目减减少少,胞胞浆浆内内细细胞胞器器丰丰富富,胞胞核核及及部部分分细细胞胞器器呈呈退退行行性性变变,可可见见细细胞胞间间连连接接结结构构;细细胞胞骨骨架架蛋蛋白白合合成成增增加加与与重重组组,细细胞胞间间缝缝隙隙连连接接通通
23、讯讯功功能能恢恢复复,提提示示DADS可可诱诱导导MGC803细细胞胞分分化化。DADS处处理理后后的的MGC803细细胞胞S期期细细胞胞含含量量减减少少,G2期期细细胞胞含含量量增增加加,细细胞胞停停滞滞于于G2期期,p21WAF1、Rb表达增强,表达增强,p21ras、c-Myc、突变型、突变型p53表达减弱。表达减弱。第26页/共94页 MTT比色实验结果第27页/共94页.DADSDADS对对MGC803MGC803细胞生长的影响细胞生长的影响第28页/共94页倒置显微镜观察MGC803细胞(20)DADS组 (20)第29页/共94页普通光镜观察MGC803细胞 HE(20)DADS
24、处理组 HE(20)第30页/共94页电镜观察微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一,本实验通过微绒毛是良恶性细胞区分的重要标志之一,本实验通过透射电镜和透射电镜和Con A凝集性实验证实了凝集性实验证实了MGC803细胞在细胞在DADS处理后,细胞表面微绒毛明显减少,对处理后,细胞表面微绒毛明显减少,对Con A的凝集率下降,的凝集率下降,表明表明MGC803细胞生物学行为表现出恶性性下降。细胞生物学行为表现出恶性性下降。未处理组未处理组MGC803细胞核浆比例大,核仁均质,以细胞核浆比例大,核仁均质,以1-2个个核仁细胞为主;胞质内细胞器稀少,细胞分化程度低。核仁细胞为主;胞质内细胞器稀少,
25、细胞分化程度低。DADS处理的处理的MGC803细胞表面微绒毛减少,细胞核浆细胞表面微绒毛减少,细胞核浆比例下降,胞质内细胞器丰富,有散在的核糖体,细胞核和比例下降,胞质内细胞器丰富,有散在的核糖体,细胞核和线粒体水肿退变,细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连线粒体水肿退变,细胞之间有腺腔结构形成并可见细胞间连接结构,细胞分化好接结构,细胞分化好。第31页/共94页第32页/共94页MGC803细胞核浆比例大,核畸形,线粒体水肿(5000倍)第33页/共94页图示DADS组细胞电镜结构第34页/共94页图示DADS组细胞电镜结构第35页/共94页结构的破坏及功能的抑制都是细胞转化早期的异常表现
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