荧光定量PCR原理及操作步骤.pptx

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1、定量PCR反应体系 actinachialyvlgstat actinachialyvlgstat模板cDNA4ulTag mixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1模板2模板 443.45ng/ul686.75 ng/ul 17.738 ng/ul26.47 ng/ul第1页/共22页定量与常规定量与常规PCRPCR的差别的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光第2页/共22页PCR分四个阶段第3页/共22页如何

2、定量？CtCt值的概念值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。第4页/共22页定量原理确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光荧光达到某一值（域值）时达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板算出样品中所含的模板量量第5页/共22页第6页/共22页起点定量与终点定量第7页/共22页荧光化学荧光化学qqSYBR Green 1SYBR Gr

3、een 1q TaqMan第8页/共22页TaqManTaqMan第9页/共22页SYBR Green I 工作原理。SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACG GTAAT未结合SYBR Green 1 dye变性变性:无荧光信号无荧光信号第10页/共22页SYBR Green I SYBR Green I 应用范围应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析-可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析第11页/共22页SYBR Green I 优点SYBR Green I 缺点第12页/共22页第13页/共22页PCR程序指南第14页/共22页UNG酶使用原理第15页/共22页金牌Tag酶活性第16页/共22页参比荧光：管家荧光ROX第17页/共22页ROX校正效果第18页/共22页96孔板设置举例第19页/共22页PCR曲线第20页/共22页标准曲线第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页