质粒DNA提取与酶切鉴定.pptx

《质粒DNA提取与酶切鉴定.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒DNA提取与酶切鉴定.pptx（16页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、一一.实验目的和要求实验目的和要求1 1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法；2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。第1页/共16页二.实验原理1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.012.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，

2、已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。第2页/共16页 2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、III型三大类，类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖A

3、TP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。第3页/共16页 其基本特点如下：(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为 5GAATTC3 3CTTAAG5 (2)、识别的核苷酸数目大多数为46个，少数识别813个；(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：第4页/共16页 (4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂

4、酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。第5页/共16页三实验材料与设备：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、Tip头、烧杯、量筒第6页/共16页试剂：LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mgmL；溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，25mmol/L Tris-H

5、Cl(pH8.0)；溶液II:0.2mol/L NaOH,1%SDS(现配现用)；溶液III:乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/L KAc,11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)；RNase A：10mg/ml；TE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0；第7页/共16页5TBE缓冲液：0.45mol/L Tris硼酸，0.01 mol/L EDTA,pH 8.0；10Loading buffer：1%SDS,0.05%溴酚兰，50的甘油；无水乙醇；70乙醇；标准分子量片段；核酸内切酶 EcoR I(TaKaRa)；EcoR

6、I酶解缓冲液(10 buffer H)；琼脂糖；溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。第8页/共16页四、碱裂解法小量制备质粒DNA1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37震荡培养1216小时；2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮3、加入100L预冷的溶液I，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2）结合，降低DNase对DNA的

7、降解第9页/共16页 4、加入200L新配制的溶液II,盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置35min;溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构 5、加入150l溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置23min；溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性 第10页/共16页6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中；7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇,振荡混匀，室温放置2min.8、12000g离心10min，弃上清液，再用70的乙醇

8、洗涤一次，12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于20或直接用于酶切。第11页/共16页质粒图谱:第12页/共16页 五、提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳 1、在1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于1.5ml离心管中 提取质粒DNA 4.0 L 10 buffer H 1.0 l EcoR I 1.0 l（2.0 U）dd H2O 4.0 L 10 L 1U:1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在20 L 反应液中反

9、应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量.2、轻轻混匀,4000g离心10秒，置于37水浴中酶解2-3h。3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。第13页/共16页六、实验结果报告 1、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法）紫外分光光度法测定核酸含量双链DNA含量=OD260nm样品稀释倍数50ugml=ug/m1样品 2、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。第14页/共16页七、思考题七、思考题 1、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用是什么？第15页/共16页感谢您的观看！第16页/共16页