紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告.pdf

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1、word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载 紫外分光光度法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。二、实验原理 1.测蛋白质含量的方法主要有：测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于 280nm 附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯比尔定律。利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：对于测定

2、那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。三、仪器与试剂 TU1901 紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液 3.00mgmL-1、0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。10mL 比色管、1cm 石英比色皿、吸量管。四、实验步骤 1.绘制吸收曲线 用吸量管吸取 2mL3.00mgmL-1标准蛋白质溶液于 10mL 比色管中，用 0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。用 1cm 石英比色皿，以 0.9%NaCl 溶液作参比溶液，在 190400nm 间每隔 5nm

3、 测一次吸光度 Abs，记录数据并作图。2.绘制标准曲线 用吸量管分别吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mgmL-1标准蛋白质溶液于 10mL 比色管中，用 0.9%NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。用 1cm 石英比色皿，以 0.9%NaCl 溶液作参比溶液，在波长 280nm 处分别测其吸光度，记录数据并作图。3.样品测定 取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长 280nm 处测其吸光度，重复三次。在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为 2.0960 mgmL-1

4、，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mgmL-1，测吸光度，重复三次 五、数据处理与结果分析 表 1 绘制吸收曲线的相关数据/nm Abs/nm Abs/nm Abs/nm Abs 400-0.003 345 0 290 0.204 235 1.604 395-0.003 340 0.001 285 0.34 230 2.673 390-0.003 335 0.001 280 0.39 225 3.094 385-0.003 330 0.002 275 0.377 220 3.003 380-0.002 325 0.002

5、270 0.329 215 2.829 375-0.002 320 0.003 265 0.278 210 2.584 370-0.002 315 0.004 260 0.23 205 2.103 word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载 365-0.001 310 0.007 255 0.188 200 0.648 360-0.002 305 0.013 250 0.184 195 0.443 355-0.001 300 0.031 245 0.275 190 0.384 350-0.001 295 0.078 240 0.65-图 1 吸收曲线 在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波

6、长 225nm 处的吸收峰远大于 280nm处，这是由于在波长 250nm 以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大，所以，蛋白的最大吸收波长应为 280nm。表 2 绘制标准曲线的相关数据 浓度 c/molL-1 0.3 0.45 0.6 0.75 0.9 Abs 0.217 0.297 0.408 0.51 0.591 图 2 标准曲线 -0.0030.4970.9971.4971.9972.4972.9973.497050100150200250300350400450/nmAbs系列1y=0.6407x+0.0202R2=0.996900.10.20.30.40.50.60.700.20.4

7、0.60.81浓度c/molLAbs系列1线性(系列1)word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载 表 3 标准曲线（y=ax+b）的相关数据 a b R2 0.6407 0.0202 0.9969 将试样所测得吸光度带入标准曲线中求蛋白质含量：稀释以后的蛋白质的浓度 cx=(Abs-0.0202)/0.6407 原试样中蛋白质浓度 c=(cx*10)/2 表 4 计算结果 Abs 0.310 0.285 0.283 cx/mgmL-1 0.4523 0.4132 0.4101 c/mgmL-1 2.261 2.066 2.051 平均值c/gmL-1 2.126|c-c|/gmL-1 0.135 0.060 0.075 所测蛋白质试样的浓度约为 2.126mgmL-1.单次测定的标准偏差:s=1)(12nccnii=2075.0060.0135.0222=0.12 相对标准偏差：sr=cs100%=%100126.212.0=5.5%