高美华《医学免疫学》westernblot-zb-第三部分.ppt

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1、Western blot 实验技术 张 蓓Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。一、实验原理 Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。第二阶段：电转移。第三阶段：固相酶免疫测定。三、三、固相固相酶酶免疫免疫测测定定检测检测ENA自自身抗体身抗体（一）原理（一）原理 （二）材料 1、洗涤液：含0.05吐温-20的pH7.4的PBS 2、酶标抗人IgG 3、阴性对照血清、阳性对照血清 4、底物溶液 5、终止液 6、恒温摇

2、床、微量加样器、反应槽、塑料袋、滴管、吸管等。（三）方法 1次日取出已封闭的NC膜，用洗涤液漂洗5次，每次1min。2.将剪下条带放入反应槽中，加入1ml洗涤液，再已加入20l血清混匀，37恒温摇动40min。3取出洗涤液漂洗5次，每次1min。4加入1ml酶标羊抗人IgG，37恒温摇动30min。5取出洗涤液漂洗5次，每次1min。6加入底物液1ml，显色10min。7加入终止液终止反应。结果判断结果判断 用用肉肉眼眼观观察察。出出现现染染色色条条带带为为阳阳性性，不不出出现现染染色色条条带带为为阴阴性性，不不同同的的疾疾病病可可以以出出现现不不同同的的条条带带。跟跟据据条带位置条带位置 判断结果。判断结果。判断标准：判断标准：1 1抗抗SmSm抗抗体体：同同时时出出现现29KD29KD、28KD28KD、13.5KD13.5KD条条带。带。2 2抗抗SSASSA抗体：抗体：60KD60KD、52KD52KD任意出现一条带。任意出现一条带。3 3抗抗SSBSSB抗体：抗体：47KD47KD、45KD45KD应用时出现条带。应用时出现条带。4 4抗抗Jo-1Jo-1抗体：抗体：55KD55KD出现条带。出现条带。5 5抗抗Scl-70Scl-70抗体：同时出现抗体：同时出现86KD86KD、67KD67KD条带。条带。